4.3. Получение фармакологических препаратов с помощью методов генной инженерии

4.3.1. Биосинтез инсулина человека в клетках кишечной палочки

Инсулин - это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата. Последний, окисляясь, обеспе­чивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует перифе­рическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит рас­пад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активиро­вание синтеза жиров и белков. При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание - диабет; при этом разрушается нормальный об­мен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние - диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учиты­вая, что поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800-1000 кг исходного сырья. Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, толь­ко 4 млн получали препарат инсулина.

Инсулин построен из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот, последовательность которых была установлена Сэн- гером в 1955 г. Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены тремя коллективами исследователей в Сша, Китае и ФРГ в 1963 и 1965 гг. Однако осуще­ствить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Тем не менее в 1980 г. в Дании (компанией «Ново индастри») был раз­работан способ превращения инсулина свиньи в инсулин человека за­мещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в це­пи В на остаток треонина. Это удалось достигнуть путем ферментатив­ного замещения с последующей хроматографической очисткой продук­та; в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. Исследования двух однокомпонентных инсулинов (чело­веческого и свиного) показали, что они не различались по активности и по времени действия. В 1982 г. инсулин производили главным образом две компании «Эли Лилли» (85 % сбыта инсулина в США и патент на его производство с 1923 г.) и «Ново индастри» (47,5 % сбыта гормона в Европе).

В организме животного две полипептидные цепи инсулина ис­ходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 амино­кислот - препроинсулина. При синтезе препроинсулина в клетках под­желудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для про­хождения молекулы сквозь мембрану клетки; эти аминокислоты отщеп­ляются, образуется проинсулин длиной 86 аминокислот. Молекула про- инсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется с по­мощью ферментов. Так образуется инсулин. Роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсули­на.

Гилберт с сотрудниками выделили и-РНК из поджелудочной же­лезы крысы, синтезировали ДНК-копию (комплементарная ДНК), кото­рая была встроена в плазмиду E. coli в среднюю часть гена пеницилли- назы (этот фермент в норме секретируется из клеток), и получили ре- комбинантную плазмиду. Как показало определение последовательно­сти ДНК, рекомбинантная плазмида содержала информацию о структу­ре проинсулина, но не препроинсулина. При трансляции и-РНК в клет­ках кишечной палочки синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Далее отщепляли пенициллиназу и удаляли средний сегмент проинсулина действием трипсина. Позднее было показано, что полученные таким образом мо­лекулы влияют на сахарный обмен, как гормон, выделенный из подже­лудочной железы крысы.

В 1979 г. в США были синтезированы гены, кодирующие А и Б цепи инсулина. Далее каждый синтетический ген встраивали в плазми- ду E. coli в конце гена -галактозидазы. После этого синтезированные полипептиды отщепляли от фермента, проводили их очистку и цепи со­единяли in vitro для получения полной молекулы инсулина.

В клетках E. coli был также осуществлен биосинтез проинсулина, а не только отдельных ее цепей. Для этого на и-РНК проинсулина син­тезировали ее ДНК-копию с помощью обратной транскриптазы (ДНК- полимераза). Этот способ имеет серьезное преимущество, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены к миниму­му. С помощью этого метода был получен высокий выход гормона - 200 г на 1000 л культуральной жидкости (это эквивалентно количеству инсулина, выделенного из 1600 кг поджелудочной железы животных).

Исследователям из компании «Генентек» потребовалось 10 меся­цев, чтобы в сентябре 1978 г. получить инсулин человека в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Этот инсулин прошел самые серьезные и длительные испытания, которые показали, что он не вызывает никаких побочных явлений, как инсулин животных (у одного из каждых 20-ти больных инсулин животных вызывает аллергию; часто наблюдаются также расстройства почек и зрения ). Кроме того, при длительном применении препарат не вызывал отрицательных иммуно­логических реакций.

Технология производства инсулина в бактериальных клетках име­ет огромные преимущества перед получением инсулина из поджелу­дочной железы животных: не зависит от перебоев или количества сы­рья, конечный продукт всегда имеет одинаковый состав и степень чи­стоты.

В октябре 1982 г. был налажен выпуск «хемулина» (препарата синтетического инсулина человека) фирмой «Эли Лилли», которая за­тратила 100 млн долларов, чтобы начать поставку продукта на рынок.