Робота 20

Реакція Хілла

Ізольовані хлоропласти, завдяки наявності хлорофілу, здатні поглинати світлову енергію і відновлювати низку сполук, наприклад: 2,6-дихлорфеноіндофенол (хімічний акцептор водню) чи K₃Fe(CN)₆. У реакції відновлення залучена фотосистема ІІ.

Мета роботи: ізолювати фракцію хлоропластів сім’ядоль огірка, провести реакцію Хілла з використанням K₄Fe(CN)₆ або 2,6-дихлорфеноіндофенолу.

Прилади і матеріали дослідження: центрифуга з охолодженням; фотоколориметр; промивалка; марля; алюмінієва фольга; ступка з товкачиком; 4 скляних пробірки; 2 пластмасових центрифужних пробірки; хімічний стакан на 50 мл; піпетки на 1, 5 та 10 мл, 0,1 М Tris-HCl рН 7,2 з додаванням 0,4 М сахарози, 0,1 М MgCl₂; 0,33 мM 2,6-дихлорфеноіндофенол; 1%-ний K₃Fe(CN)₆; 1%-ний K₄Fe(CN)₆; 0,5%-ний FeCl₃; аскорбінова кислота кристалічна; сім’ядолі 5-6-ти добових рослин огірка.

Хід виконання роботи

І. Отримання осаду, збагаченого хлоропластами

1. Зважують 2 г сім’ядоль огірка і розтирають в охолодженій ступці. До гомогенізованої тканини додають 10 мл 0,1 М Tris-HCl рН 7,2, що містить 0,4 М сахарозу, 0,1 М MgCl₂ і ще раз розтирають.

2. Гомогенат відфільтровують через 4 шари марлі в охолоджений хімічний стакан. Фільтрат розділяють на дві проби у центрифужні пробірки, які після зрівноваження на технічній вазі, центрифугують протягом 10 хв при 4000 об/хв.

3. Супернатант відкидають, а осад у кожній пробірці суспендують у 0,1 М Tris-HCl буфері (рН 7,2. ). Це і є субклітинною фракцією, збагаченою хлоропластами.

ІІ. Реакція Хілла

а)

1. Суспензію, що містить хлоропласти, переносять до двох скляних пробірок. У обидві пробірки вносять по 1 мл 1%-ного K₃Fe(CN)₆. Вміст пробірок струшують і залишають на 15 хвилин: один варіант на світлі, другий – у темряві.

2. Паралельно у двох інших пробірках проводять такі реакції:

1 мл K₃Fe(CN)₆ + 1 крапля 0,5% FeCl₃;

1 мл K₄Fe(CN)₆ + 1 крапля 0,5% FeCl₃

3. Ту ж саму реакцію проводять із вмістом пробірок, які попередньо були поміщені на світло або в темряву. До обох сумішей додають по краплі 0,5%-ного FeCl₃ і, не вимішуючи вмісту, відмічають забарвлення.

б)

1. До двох скляних пробірок додають по 0,3 мл 0,33 мM 2,6-дихлорфеноіндофенолу і по 5 мл 0,1 М Tris-HCl (рН 7,2) із 0,4 М сахарозою. Одну з пробірок щільно обгортають алюмінієвою фольгою. В обидві пробірки додають по 0,1 мл суспензії хлоропластів. До третьої пробірки (контроль) вносять 5,3 мл 0,1 М Tris-HCl рН 7,2 із 0,4 М сахарозою та 0,1 мл суспензії хлоропластів.

2. Вміст пробірок перемішують, закривають корками і поміщають у хімічний стакан з водою, розміщений на відстані близько 20 см від лампи (100 Вт). Пробірки освітлюють протягом 5 хвилин.

3. Вимірюють екстинкцію забарвленого розчину при λ=625 нм. Як контроль використовують воду.

4. Від значень екстинкції, отриманих для зразків, що містять 2,6-дихлорфеноіндофенол віднімають значення екстинкції контрольного зразка і за формулою вираховують концентрацію 2,6-дихлорфеноіндофенолу в освітленому і затемненому зразках:

С_{(2,6-дихлорфеноіндофенолу)} = D₆₂₀∙630 (нмоль/л)

5. Окиснений 2,6-дихлорфеноіндофенол має синє забарвлення, відновлений – безбарвний. Різниця між вмістом 2,6-дихлорфеноіндофенолу у пробірках, інкубованих у темряві і на світлі, визначає інтенсивність реакції Хілла.

6. Висновки.