Інгібування катехолоксидази в бананах важкими металами

До стресових факторів для рослин належать і йони важких металів, які у високих концентраціях інгібують ріст та розвиток рослин і спричиняють їхню загибель. На клітинному рівні ці елементи спричиняють порушення окисно-відновних процесів, індукуючи появу у значних кількостях вільних радикалів, інгібуючи активність низки ензимів, в т. ч. і катехолоксидази. Якщо взяти невеликий шматок фрукта і залишити його протягом деякого часу на повітрі, то пошкоджений плід через кілька хвилин стає брунатним (див. роботу №25). Реакція зумовлена активністю катехолоксидази, що перетворює катехол у жовтий пігмент за наявності кисню. Далі відбувається окиснення жовтого пігмента до коричневого меланіну.

Катехол	====>	Жовтий пігмент	====>	Коричневий Mеланін
	Катехолоксидаза		Кисень повітря

Ензим катехолоксидазу можна легко виділити із плодів банана.

Мета роботи: виділити катехолоксидазу та дослідити, як різні концентрації йонів свинцю впливають на активність цього ензиму.

Прилади та матеріали дослідження: І. Екстракція ензиму: вага; центрифуга; ступка та товкачик; марля; невелика мензурка; центрифужна пробірка; пісок; дистильована вода (25 мл); стиглий плід банана (зріз товщиною близько 1 см = 8 г); ІІ Вплив важких металів на активність катехолоксидази: маркер (склограф); буферний розчин pH 7 (див. додаток); 0,09M (1%-ний) розчин катехолу; 0,13M (5%-ний) розчин ацетату свинцю; 2 x 10 мл шприци; 5 термостійких пробірок; 5 дослідних пробірок; 2 x 1мл піпетки; фотоколориметр; штатив для дослідних пробірок; 5 лійок; 5 паперових фільтрів; гумові рукавички.

Хід виконання роботи

І. Екстракція ензиму

1. Наважку 8 г банана розтирають у охолодженій ступці разом із невеликою кількістю піску і 25 мл дистильованої води. Отриману суміш фільтрують через марлю у мензурку. Фільтрат буде містити ензим, катехолоксидазу.

2. Іноді, для того, щоб осадити невеликі шматки плода на дно центрифужної пробірки, проводять додаткове центрифугування протягом трьох хвилин при 3-х тис об/хв Супернатант використовують для визначення активності ензиму.

Іі Вплив важких металів на активність атехолоксидази

1. Позначають 5 термостійких пробірок літерами A, Б, В, Г та Д.

2. Відповідно до нижче наведеної таблиці, за допомогою шприца на 10 мл, додають різні об’єми буфера та ацетату свинцю до кожної з пробірок. Уважно стежать, щоб не забруднити буфер ацетатом свинцю (різні піпетки).

Дослідна пробірка	A	Б	В	Г	Д
Об’єм буфера, мл	10	9	8	5	2
Об’єм ацетату свинцю, мл	0	1	2	5	8

 Дуже обережно поводьтеся із розчином ацетату свинцю. Він ТОКСИЧНИЙ!

3. У кожну із пробірок вносять по 1 мл розчину катехолу*.

*Примітка. 1%-ний розчин катехолу придатний для використання лише протягом 2-3 днів з часу приготування, повинен зберігатися у темряві.

 УВАГА! Розчин катехолу шкідливий. Уникайте контакту із шкірою!

4. До кожної пробірки додають по 1 мл витягу, що містить катехолоксидазу, екстраговану із банана.

5. Для спостереження більш чіткого кольору вміст кожної пробірки фільтрують через паперовий фільтр у чисту дослідну пробірку. Утворення жовтого забарвлення ілюструє наявність у банановому екстракті активного ензиму, що перетворює катехол.

6. Активність катехолоксидази можна оцінювати візуально або за допомогою фотоколориметра, визначаючи екстинкцію розчину при 440 нм.

7. Оформляють таблицю з відповідними заголовками, підсумовуючими результати.

8. Кінцеві результати подати у вигляді графіка. По горизонтальній x-осі позначити об’єм доданого ацетату свинцю, по вертикальній y-осі – Е₄₄₀.

9. Висновки.

Робота 54

Визначення активності процесів перекисного окиснення ліпідів в рослинних тканинах за утворенням малонового диальдегіду

Процеси окиснення в живих організмах у ряді випадків відбуваються за участю вільних радикалів. Індукція цих процесів часто обумовлена кисневими радикалами: супероксидним аніон-радикалом, гідроперекисним радикалом, гідроксильним радикалом, стабільним продуктом відновлення кисню – пероксидом водню, а також синглетним киснем. Утворення цих активних форм кисню пов‘язане як з процесами, що відбуваються в клітині в нормі (наприклад, у світлових реакціях при фотосинтезі), так і у відповідь на стресові чинники (водний дефіцит, забруднення середовища, низькі температури тощо). Генерація активованих форм кисню може викликати, в першу чергу, пошкодження мембранних структур у клітині внаслідок вільнорадикальних процесів, які призводять до перекисного окиснення ненасичених жирних кислот ліпідів мембран. Це збільшує проникність мембран для багатьох речовин та іонів.

Малоновий диальдегід (МДА) – продукт перекисного окиснення ліпідів. Цей біфункціональний альдегід здатний утворювати шиффові основи з аміногрупами білка, виступаючи як зшиваючий агент. У відповідь на різні стресові чинники у клітинах рослин відбувається збільшення вмісту МДА і це може служити показником активності окислювальних процесів, обумовлених кисневими радикалами. Визначення вмісту МДА у рослинних тканинах базується на його реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК), в результаті чого утворюється забарвлений продукт з максимумами поглинання при довжинах хвиль 532 нм та 600 нм.

Мета роботи: переконатися, що перекисне окиснення ліпідів – надійний маркер стресового стану рослини

Прилади та матеріали дослідження: вага; центрифуга; водяна баня; спетрофотометр; посудина з льодом; ступка та товкачик; ножиці; центрифужні пробірки; дослідні пробірки з притертими корками; штатив для дослідних пробірок; маркер (склограф); піпетки на 5 мл; дистильована вода; 0,5 % розчин ТБК у 20% трихлороцтовій кислоті; лійки; гумові рукавички; 5-ти денні проростки кукурудзи чи інших рослин, вирощені на дистиляті (контроль) та 10^-6М розчині ацетату свинцю (дослід).

Хід виконання роботи

1. Наважки пагонів та коренів (по 500 мг) з контрольних і дослідних рослин, подрібнюють ножицями й розтирають у фарфорових ступках в розчині тіобарбітурової кислоти. Кількісно переносять у пробірки з притертими корками. На процес розтирання матеріалу і кількісного перенесення у пробірки використовують 5 мл розчину ТБК.

 УВАГА! Розчин ТБК шкідливий. Уникайте контакту із шкірою! Працюйте під витягом!

2. Пробірки з досліджуваними пробами інкубують 30 хвилин на киплячій водяній бані, потім охолоджують в посудині з льодом доти, поки проби не замерзнуть.

3. Проби розморожують і переносять у центрифужні пробірки. Центрифугують 15 хв при 8000 об/хв.

4. Надосадову рідину колориметрують при довжинах хвиль 532 нм та 600 нм.

5. Визначають вміст малонового диальдегіду у досліджуваних зразках, враховуючи об’єм витягу і масу зразка, за формулою:

Х=(D₅₃₀-D₆₀₀)∙V/ε∙n,

Де Х – кількість МДА у мМ/г сирої ваги,

V – об‘єм реакційної суміші,

ε∙- коефіцієнт екстинції, складає 155 мМ^-1см^-1

n – наважка, г

6. Висновки.