osn_san_mikr

173

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий (темно-красных, красных с металлическим блеском, выпуклых с красным центром), дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме среды.

Для определения наличия термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) делают посев 2-3 изолированных типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, красных с металлическим блеском) в пробирки, содержащих среду с лактозой, предварительно прогретую до 440С.

После засева пробирки инкубируют при 44±0,50С в течение 24 часов, хотя уже через 4-6 часов допускается первичный учет результатов роста бактерий – образования кислоты и газа.

При выявлении кислотообразования и газообразования у выделенных культур бактерий выдают положительный ответ о наличии в исследуемом объеме воды термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ).

При отсутствии кислоты и газа при учете (просмотре) посевов инкубацию проводят в течение еще 24 часов при 440С и выдают окончательный ответ.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий методом фильтров. Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие облигатно анаэробные палочковидные микроорганизмы рода Clostridium, редуцирующие

сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44±10С в течение 16-18 часов.

Метод определения содержания сульфитредуцирующих клостридий основан на выращивании посевов из анализируемых проб воды на железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа выросших колоний.

Методика проведения анализа.

Исследуемую пробу воды (20,0мл) для исключения возможности развития вегетативных форм бактерий прогревают при 750С в течение 15 минут в пробирке на водяной бане.

Прогретую пробу фильтруют через мембранный фильтр, который затем помещают на железосульфитный агар (чашки Петри залиты питательной средой тонким слоем) фильтрующей поверхностью вниз – так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем всю поверхность среды с фильтром заливают расплавленным железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий.

Посевы культивируют при 44±10С в течение 16-18 часов, хотя окончательный результат получают через 24 часа и выражают его числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих бактерий в 20,0мл воды.

Если не отмечен рост черных колоний на всех фильтрах, то в протоколе анализа дают ответ «сульфитредуцирующих клостридий не обнаружено в 20,0мл воды».

174

При наличии черных колоний бактерий – их подсчитывают на всех фильтрах, а результат анализа вычисляют по формуле:

X = (a х 20) / V, где

Х – число клостридий в 20,0мл; а – число подсчитанных колоний;

V – профильтрованный объем воды.

Определение колифагов титрационным методом.

Колифаги – бактериофаги (вирусы), способные лизировать Е.coli и формировать на питательном агаре при 370С через 18-24 часа зоны лизиса бактериального газона (бляшки).

Титрационный метод определения колифагов.

Данный метод основан на определении колифагов в пробах питьевой воды путем предварительного накопления их в среде обогащения на культуре Е.coli с последующим выявлением зон лизиса газона на питательном агаре и

предназначен для проведения текущего анализа питьевой воды. Методика проведения количественного анализа.

В исследуемую пробу воды объемом 100,0мл вносят 10,0мл 10-кратного разведения питательного бульона и 1,0мл смыва тест-культуры с плотной питательной среды или 2-4-х часовой бульонной культуры.

Для контроля культуры 0,1мл смыва Е.cоli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Исследуемую пробу воды (100,0мл) и чашку Петри с контролем помещают в термостат и инкубируют при 37±10С в течение 18±2 часа, после чего из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10,0мл и добавляют 1,0мл хлороформа. Пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают для равномерного распространения хлороформа по объему пробы, и оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа (не менее 15 минут).

Впредварительно расплавленный и остуженный до 45-490С питательный агар добавляют смыв бактерий Е.coli (из расчета 1,0мл на 100,0мл агара) и перемешивают.

Встерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1,0мл

обработанной хлороформом пробы воды и заливают смесью расплавленного до 45-490С питательного агара объемом 12,0-15,0мл и осторожно перемешивают.

Аналогичным образом готовят также одну дополнительную чашку Петри

для контроля культуры Е.coli.

Обе чашки помещают в термостат при 370С на 18-24 часа, после чего в проходящем свете осуществляют просмотр посевов.

Проба считается положительной «колифаги обнаружены в 100,0мл воды»

при наличии лизиса на чашке с пробой воды и при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

При наличии зон лизиса в контроле культуры результат анализа считается недействительным и выдается отрицательный ответ («колифаги не обнаружены

в100,0мл воды»).

175

Прямой метод определения колифагов.

Данный метод основан на определении колифагов в нормируемом объеме питьевой воды (100,0мл) путем прямого посева пробы воды и последующего учета зон лизиса (бляшек, негативных колоний) на культуре Е.соli, посеянной методом «газона» на чашки Петри с питательным агаром и предназначен для исследований по эпидемическим показаниям.

Методика проведения количественного анализа.

Впредварительно расплавленный и остуженный до 45-490С питательный агар двойной концентрации добавляют смыв бактерий Е.соli (из расчета 2,0мл на каждые 100,0мл агара) и перемешивают.

Исследуемую пробу воды 100,0мл разливают по 20,0мл в пробирки, нагревают до 35-440С и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку вносят по 20,0мл смеси агара с культурой Е.соli.

Для контроля культуры Е.соli в одну чашку Петри вносят 20,0мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 35-440С, заливают 20,0мл приготовленного агара с Е.соli, перемешивают и оставляют при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром помещают дном вверх

втермостат и инкубируют при 37±10С в течение 18-24 часов, после чего в проходящем свете осуществляют просмотр посевов.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек (зон лизиса), появившихся на 5-ти чашках.

Вконтрольной чашке бляшки (зоны лизиса) должны отсутствовать.

При высоких концентрациях фагов наблюдается разная картина лизиса. Слияние негативных колоний (зон лизиса) дает «ажурный газон» Е.соli: рост единичных колоний Е.соli на фоне сплошного лизиса либо полное отсутствие роста на чашке.

Предварительный учет результатов можно проводить через 5-6 часов инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18-24 часа. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100,0мл пробы воды.

Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан окончательный ответ «колифаги обнаружены в 100,0мл воды».

При получении отрицательного результата при работе прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрационного метода.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

13.2.2. Санитарно-микробиологическое исследование почвы Определение титра нитрифицирующих бактерий.

Появление и увеличение содержания нитрифицирующих бактерий в почве указывает на развитие процессов ее самоочищения.

176

Методика проведения анализа.

Готовят 10-кратные разведения почвенной суспензии (от 1:100 до 1:104) и затем производят посев во флаконы с жидкой синтетической средой Виноградского. В качестве контроля используют два флакона с незасеянной средой Виноградского. Посевы и контрольные флаконы инкубируют при температуре 280С в течение 14-15-ти суток.

Уже на 5-7-е сутки культивирования с помощью качественной пробы с дифениламином проверяют образование азотистой или азотной кислоты. Для этого к капле среды, помещенной на стеклянную пластинку, добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте

– появление синего окрашивания указывает на присутствие нитратов. В контрольной среде изменения окраски не происходит.

Для более полной оценки процесса самоочищения почвы можно также определять группы микроорганизмов, быстро разлагающих органический субстрат: бациллы, актиномицеты, грибы.

На свежее фекальное загрязнение почвы указывают:

–обнаружение энтерококков;

–большое количество БГКП при отсутствии нитрифицирующих бактерий

итермофилов;

–относительно высокое содержание вегетативных форм клостридий. Загрязнение почвы навозом, компостом или сточными водами и стадию

разложения их органического субстрата помогает оценить определение термофильных бактерий.

13.3.3. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов

(ГОСТ 50474-93)

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, в том числе на продукты детского лечебного питания, мясо, включая мясо птицы, субпродукты и мясные продукты, рыбу, молоко и молочные продукты, маргарин, майонез, свежие и свежезамороженные овощи, картофель и т.д.

Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП).

К бактериям группы кишечных палочек (БГКП) относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при температуре 37-440С в течение 24-48 часов, в основном являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia.

Методика проведения анализа.

Посев пробы продукта проводят в среду Кесслера с лактозой и поплавками с соблюдением соотношения продукта и среды 1:10 и инкубируют при температуре 370С в течение 24 часов.

При отсутствии признаков роста (газообразование или помутнение среды Кесслера) дают заключение об отсутствии БГКП в данной пробе продукта.

При наличии признаков роста из подозрительных колб или пробирок производят высев на чашки со средой Эндо или Левина. При этом посев

177

выполняют петлей из каждой колбы или пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний – на отдельный сектор, а лучше – на отдельную чашку.

Посевы инкубируют при температуре 370С в течение 18-24 часов. Учет результатов анализа.

При отсутствии на среде Эндо и Левина колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дающих на среде Эндо крупные с металлическим блеском или без него, розовые или бледно-розовые колонии, на среде Левина – черные с металлическим блеском, темные с черным центром, сиреневые с черным центром, засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

При наличии на среде Эндо и Левина типичных или подозрительных для кишечной палочки (колиформных бактерий) колоний продолжают их изучение.

Для этого из изолированных колоний, характерных или подозрительных на БГКП, делают мазки, окрашивают их по Граму и на наличие спор, и затем микроскопируют.

Обнаружение в мазке грамотрицательных палочек, не содержащих спор, указывает на наличие БГКП в анализируемой массе продукта и его несоответствие микробиологическому нормативу.

Исследуемый продукт считается соответствующим нормативу на БГКП при подтверждении принадлежности подозрительных колоний к роду Erwinia и отсутствии других микроорганизмов, типичных для БГКП.

Для определения принадлежности к роду Erwinia типичные для БГКП колонии, выросшие на среде Эндо или Левина пересевают на питательный агар с 5% сахарозой, на котором бактерии рода Erwinia дают выраженный мукоидный рост, не свойственный колиформным бактериям.

Определение энтерококков.

Определение энтерококков проводят в случае обнаружения в партии продуктов значительного превышения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Методика проведения анализа.

По 0,1см3 жидкого продукта засевают на поверхность молочной среды с полимиксином в 2 чашки Петри и инкубируют при 370С в течение 48 часов.

При учете результатов на обеих чашках подсчитывают количество только типичных колоний энтерококков – красного цвета с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды. При этом среднеарифметическое число колоний умножают на 10 или 100, получая количество энтерококков в 1,0г или 1,0см3 продукта.

Одновременно 3-5 типичных колонии отсевают на скошенный мясопептонный агар для накопления чистой культуры с целью дальнейшей идентификации. После инкубации при 370С в течение 24 часов из исследуемой культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Кроме этого, определяют каталазную активность исследуемой культуры, поскольку энтерококки перекись водорода не разлагают. Для этого культуру

178

помещают на чистое обезжиренное предметное стекло, добавляют 1% раствор перекиси водорода и смешивают – если при смешивании пузырьки газа не выделяются, то реакция отрицательна.

Известно, что энтерококки способны к росту на средах с высоким содержанием желчи, поэтому исследуемую культуру также засевают в бульон, содержащий 40% желчь, и инкубируют при 370 в течение 18-24 часов.

Возможный рост изучаемых культур в посевах на жидкой среде обязательно подтверждают микроскопией мазка и постановкой теста на каталазу.

Обнаружение значительного роста энтерококков при посеве исследуемого материала свидетельствует о необходимости контроля за данным продуктом.

Определение количества дрожжей и плесневых грибов.

Метод основан на количественном подсчете колоний дрожжей и плесневых грибов, вырастающих на специальных плотных питательных средах с антибиотиками при температуре 240С в течение 5 суток после посева исследуемого материала.

Методика проведения анализа.

Из каждой пробы делают высев по 1,0см3 нативного продукта или по 1,0см3 разведений продукта 1:10 и 1:100 на две чашки Петри со средой Сабуро.

Через 15-20 минут в каждую чашку добавляют по 14,0см3 одной из агаризованных сред, охлажденных до 45-490С и антибиотики. После тщательного перемешивания среды, избегая при этом образования пузырьков, и застывания агара, чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при 240С в течение 5 суток (120 часов) с предварительным учетом роста через 3 дня.

При учете посевов проводят подсчет соответствующих колоний на каждой чашке отдельно.

При этом колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально – по культуральным свойствам, при необходимости проводят микроскопическое исследование из колоний.

Типичные колонии плесневых грибов имеют поверхность, покрытую пушистым мицелием, похожим на вату.

Рост дрожжей сопровождается образованием крупных выпуклых блестящих серовато-белых или беловато-желтых колоний с гладкой поверхностью, ровным краем, сметанообразной консистенцией. Кроме того, по мере роста и увеличения размеров колонии дрожжей могут приобретать перламутровый оттенок и куполообразное возвышение.

Для количественного учета результатов посевов путем подсчета выросших колоний (КОЕ) отбирают те чашки, на которых выросло от 5 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

179

Метод выявления и определения бактерий вида Listeria monocytogenes.

Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую селективную питательную среду (с предварительным обогащением), последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и культивировании посевов при оптимальных условиях. Принадлежность выделенных колоний к Listeria monocytogenes определяют по биохимическим и антигенным свойствам.

Отбор и подготовка проб для анализа.

Масса или объем навески должны составлять 25,0±0,1г (см3) для мясных продуктов и 50,0-100,0г (см3) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания.

Методика проведения анализа.

Соотношение между количеством продукта детского, лечебного питания и питательной средой должно составлять 1:9, поэтому навеску исследуемого пищевого продукта массой 25,0±0,1г или объемом 25,0±0,1см3 вносят в 225,0см3 (мл) жидкой среды для предварительного обогащения.

Посевы инкубируют при температуре 30-310С в течение 24-26 часов, затем навеску засевают на бульон Фразера, содержащий эскулин, в соотношении 1:9.

При росте листерий на бульоне Фразера отмечается почернение среды, в то время как на питательной среде без эскулина почернения не происходит.

После инкубирования продукта на бульоне Фразера содержимое среды независимо от наличия в нем изменений в количестве 1,0см3 пересевают в 10,0см3 одной из сред обогащения и вновь посевы инкубируют при температуре 37-380С в течение 48 часов.

После этого при отсутствии роста характерных для листерий колоний на селективно-диагностических средах дают заключение об отсутствии Listeria monocytogenes в исследуемой пробе продукта.

При обнаружении роста листерий, сопровождающегося почернением колоний и среды, по комплексу других биологических свойств определяют принадлежность колоний к бактериям данного рода. С этой целью, используя стандартные методики, определяют:

–отношение к окраске по Граму;

–наличие или отсутствие капсул и спор;

–подвижность бактерий при температуре 22-230С и 37-380С;

–каталазную активность;

–нитратредуцирующие свойства.

К бактериям рода Listeria выделенные микроорганизмы могут быть отнесены, если они – грамположительные короткие тонкие палочки, спор и капсул не образуют, подвижны при температуре 22-230С, каталазопозитивны, не восстанавливают нитраты в нитриты.

Дальнейшую идентификацию до вида Listeria monocytogenes проводят общепринятыми методами, используя постановку реакции агглютинации по идентификации с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой.

180

Положительным результат анализа продукта на содержание Listeria monocytogenes считается, если из среды накопления выделены грамположительные короткие тонкие неспорообразующие палочки, капсулы не имеют, подвижны при температуре 22-230С, неподвижны при 37-380С, каталазоположительны, гидролизующие эскулин, ферментирующие с образованием кислоты рамнозу и мальтозу, не сбраживающие маннит и ксилозу, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию агглютинации по идентификации с соответствующей агглютинирующей сывороткой.

Определение бактерий рода Proteus.

Сущность метода заключается в определении у выделенной культуры морфологических свойств, характера роста (культуральных свойств), способности гидролизовать мочевину и образовывать сероводород.

Методика проведения анализа.

0,5мл анализируемой взвеси бактерий (из предварительно выделенной чистой культуры) вносят в конденсационную воду свежескошенного мясопептонного агара, разлитого в широкие пробирки, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича).

Через 18-24 часа инкубации при температуре 370С основное внимание уделяют возможному образованию ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком на поверхности скошенного агара и подъему культуры из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды.

При наличии такого роста, характерного для бактерий рода Proteus, культуру бактерий микроскопируют, изучают ее подвижность в препарате «висячая капля» и биохимические свойства стандартными методами.

Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, дающих ползучий рост вследствие высокой подвижности, ферментирующих глюкозу и мочевину и не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий рода Proteus.

Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при 300С в течение 72 часов.

Для определения количества мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний.

Из каждой пробы делают высев на 2-3 чашки, причем каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1,0см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10,0-15,0см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40-450С питательной среды для определения общего количества бактерий. Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1,0см3 и 0,1см3.

181

Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат при температуре 30±10С на 72 часа.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, и пользуясь лупой с увеличением в 4-10 раз.

При большом числе колоний дно чашки делят на 4 и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на 2-3-х секторах, находят среднее арифметическое и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом, находят общее количество колоний, выросших на одной чашке, и вычисляют общее количество бактерий в 1,0см3 или 1,0г продукта по следующей формуле:

Х= n × 10m, где

Х– общее количество бактерий в 1,0см3 или 1,0г продукта; n – число колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m – число десятикратных разведений.

Определение содержания спор мезофильных анаэробных бактерий.

Методика проведения анализа.

Посев 1,0см3 исследуемого образца (для молока – из нулевого, первого и второго, а для сыров – из первого и второго разведения) производят в пробирку с 10,0±2,0см3 специальной питательной среды, предварительно выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 минут и охлажденной.

При этом каждый образец выбранных разведений исследуемого молока и сыра засевают в 2 пробирки с питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания и заливая сразу после посева пробирки слоем предварительно расплавленного и охлажденного до 450С водного агара, высота которого должна быть не менее 20,0±5,0мм.

Посевы инкубируют при 37±10С в течение 72 часов.

Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого образца молока или сыра определяют по появлению разрывов агарового столбика, образуемых в результате газообразования при росте этих бактерий.

Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе молока определяют по числу пробирок, в которых они дали рост.

Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе сыра определяют по числу пробирок, в которых они дали рост с посевом 0,1см3 и 0,01см3 (см. таблицу 32).

182

Таблица 32 Подсчет спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе сыра

Определение перфрингенс-титра.

Определение перфрингенс-титра как показателя загрязнения яиц и птиц, кулинарной продукции облигатными анаэробами рода Clostridium (C.perfringens) является важным критерием для их санитарной оценки.

Методика проведения анализа.

Исследуемую микробную суспензию титруют путем 10-кратных разведений. Затем из каждого разведения берут по 1,0мл и заливают в пробирки с молоком, разлитым по 5,0мл.

Посевы прогревают на водяной бане при 800С в течение 15 минут. Наличие бактерий C.perfringens регистрируется по наступившему

характерному свертыванию молока с полным отделением сыворотки и образованию губчатого сгустка на поверхности благодаря газообразованию.

Титром C.perfringens (перфрингенс-титр) считают предельное разведение микробной суспензии, которое дает на молочной среде развитие колоний C.perfringens.

Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов

(СанПиН 42-123-4940-88).

Определение Е.coli в продуктах детского питания.

Бактерии вида E.coli, входящие в группу колиформных бактерий и являющиеся индикатором относительно свежего фекального загрязнения, представляют собой грамотрицательные, неспорообразующие палочки, не утилизирующие цитрат, способные расти и ферментировать лактозу при температуре выше температуры тела (от 440С до 45,50С).