5. Виділення чистої культури анаеробних бактерій

Матеріал із вогнищ гнійної інфекції рекомендується забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час між взяттям матеріалу та посівом його на живильне середовище повинен бути максимально коротким.

Для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні живильні середовища, які не містять кисню і мають низький окисно-відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори - резазурин, метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зростанні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазурин за­барвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій - в голубий. Такі зміни свідчать про неможливість використання середовищ для культивування анаеробних мікробів. Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в середовище не менше 0,05 % агару – збільшуючи в'язкість, сприяє зменшенню надхо­дження кисню. Досягається використанням свіжих (не пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних середовищ.

Через особливості бродильного типу метаболізму анаеробних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти і вітаміни середовищ. Найчастіше використовують серцево-мозковий й печінковий настої, соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, триптон. Обов'язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадіон, цільна або гемолізована кров.

Методи створення анаеробних умов – обмеження доступу кисню. Методи – механічних, фізичних, біологічних.

Фізичні методи

1. Перед посівом регенерують для видалення надлишку розчиненого кисню – кип'ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, потім швидко охолоджують до необхідної температури.

2. Для попередження проникненя кисню в середовище його заливають шаром стерильної вазелінової олії/парафіном.

3. Стовпчик живильного середовища у пробірках – достатньо високий (10-12 см). Кисень дифундує в товщу стовпчика на глибину до 2 см, нижче створюються сприятливі умови для культивування анаеробних мікробів. Краї чашки парафінують або закривають пластиліном. За деякий час на поверхні середовища виростають колонії як аеробних, так і анаеробних мікробів. При поглинанні кисню Serratiamarcescensдає ріст блідо-рожевих або безбарвних колоній, а при порушеннях герметичності - яскраво-червоні. На іншій половині чашки виростають колонії анаеробних мікробів.

2. Метод Хеннеля ("годинникових скелець"). Матеріал засівається на поверхню живильного середовища діаметром 2-2,5 см. Зверху покривається "годинниковим склом", заповненим шаром МПА і засіяним Serratiamarcescens. Аеробні мікроби, поглинаючи кисень, створюють умови для сприятливого росту анаеробних збудників.

6. Виділення та ідентифікація анаеробних мікроорганізмів

Обов'язковим є дотримання на всіх етапах дослідження умов анаеробіозу, використовуючи для цього трикомпонентну газову суміш (у певному співвідношенні азот, водень та вуглекислий газ) чи систему "Gas Generating Box".

Однак збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції можна виді­ляти та ідентифікувати за іншою схемою.

Перший етап (І день дослідження) вивчають макроскопічні особливості клінічного матеріалу, роблять мазок і забарвлюють його за методом Грама. Матеріал засівають на середовище Кітта-Тароцці та молоко. Попередньо середовище регенерують на киплячій водяній бані протягом 10-20 хв і охолоджують. Безпосередньо після посіву матеріалу середовище нагрівають на водяній бані при 80°С протягом 20 хв для знищення вегетативних неспорових форм мікробів. Середовища ставлять у термостат і при температурі 37 °С культивують 1-3 доби.

Другий етап вивчають прояви росту мікроорганізмів (помутніння, утворення осаду та газу на середовищі Кітта-Тароцці, пептонізація молока). Оскільки середовище Кітта-Тароцці зверху залите шаром вазелінової олії для запобігання доступу кисню, в нього занурюють пастерівську піпетку, набирають рідину, з якої готують мазок, фарбуючи його за методом Грама. Під мікроскопом у мазку можна бачити великі грампозитивні паличкоподібні бактерії. Після посів за методами Вейнберга або Цейсслера для одержання ізольованих колоній.

За методом Вейнберга готують декілька вузьких високих пробірок (3-4) з розтопленим і охолодженим до 42-45 °С цукровим МПА. Можливе використання середовища Вільсон-Блера. Матеріал із середовища Кітта-Тароцці вносять у першу пробірку за допомогою пастерівської піпетки, ретельно перемішують, потім переносять у 2, 3. Для застигання агару їх швидко охолоджують під струменем холодної водопровідної води. За рахунок цього живі мікробні клітини фіксуються в певних ділянка агару. Після застигання агару пробірки культивують при опти­мальній температурі протягом 3 -2 діб для утворення ізольованих колоній.

Вміст кожної пробірки можна всмоктати у пастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона. Останні мають довжину біля 30 см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній кінець їх, який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаеробних бактерій. Для того щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на певному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею або голкою, переносять у відповідне середовище.

Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера матеріал із сере­довища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі пастерівською піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров'яним агаром і роблять посів шпателем за методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають другу чашку, потім третю. Чашки перевертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, створюють анаеробні умови, потім – у термостат при температурі 3 7 °С на 2-3 доби. На останній чашці виростають ізольовані колонії.

Третій етап дослідження – вивчення морфологічних особливостей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджуються форма, величина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсівають у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний час при оптимальній температурі.

Четвертий етап – звертають увагу на особливості росту чистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять іден­тифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, біохімічними та біологічними ознаками. Обов'язково використовують визначення токсигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лабораторних тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроорганізмів.

На підставі вивчення різноманітних властивостей мікроорганізмів робиться висновок про належність їх до того чи іншого виду.