8.Чутливість лабораторних тварин до збудників інфекційних захворювань

Штам –мікроби одного виду, виділені з різних джерел, або з одного й того ж самого джерела, але в різний час. Чиста культура бактерій – мікроорганізми одного виду, нащадки однієї мікробної клітини, які виросли на (в) живильному середовищі.

4. Етапи виділення чистих культур мікроорганізмів та їх ідентифікація

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів:

Перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал, вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. Посів проводять бактеріологічною петлею, за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватно-марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем, ставлять у термостат при оптимальній t (37 °С) на 18-48 год. Мета — одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.

Другий день (ІІ етап дослідження) на поверхні щільного живильного сере­довища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст/ізольовані колонії. Колонія - це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні/в товщі живильного середовища. Кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), їх склад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах – прояв їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають, вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і по­верхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. Досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній досліджують при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи, мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії. Характеризують колонії за різними ознаками: величиною (діаметром) – великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-2 мм), карликові/точкові (менше 1 мм). Форма колоній: правильно кругла, не­правильна (амебоподібна), ризоїдна. Бувають прозорі (пропускають світло), мутні.

За рельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії: плоскі, опуклі, куполоподібні, краплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі, плоскі (стеляться по поверхні середовища), із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою. Поверхня колоній – матова/блискуча, з глянцем, суха/волога, гладенька/шорстка. Гладенькі колонії – S-форми, шорсткі – R-форми.

Форма шорстких поверхонь: зморшкувата, гірозна, бородавчаста, шагренева, з радіальною посмугованістю.

Деякі синтезують пігменти: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

За консистенцією: пастоподібні, в'язкі/слизові, сухі, крихкі.

З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вив­чення морфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухо­мість бактерій у "висячій" чи "надавленій" краплі. Рештки досліджуваних колоній знімають із поверхні середовища, засівають на скошений агар/на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки/ чашки з посівами – у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

На рідких живильних середовищах бактерії ростуть по-різному.

Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір може не змінюватись/набуває кольору пігменту.

Деколи утворюється осад на дні пробірки: крихто-подібний, гомогенний, в'язкий, слизистий та ін. Середовище над ним може залишатись прозорим/ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад – сірувато-білий/жовтуватий. Подібним чином ростуть – анаеробні бактерії.

Пристінковий ріст – утворення пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище – прозоре.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Утворюється ніжна безбарвна/голубувата плівка, ледь помітний нальот на поверхні, зникає при струшуванні/збовтуванні середовища. Плівка: волога, товста, в'язка, слизиста та прилипає до петлі, тягнучись за нею, щільна, суха, крихка плівка, колір залежить від пігменту.

Виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного живильного середовища для одержання ізольованих колоній.

Третій день (III етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів, ідентифікують.

Звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі, роблять мазок, фарбують за Грамом. Якщо під мікроскопом однотипні (розміри, тинкторіальні властивості) – культура чиста. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками – морфологічна ідентифікація. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками – культуральна ідентифікація.

Вивчають біохімічні властивості: цукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетворення нітратів у нітрити. Існують спеціальні живильні середовища, які засівають м/о (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями – біохімічна ідентифікація.

Для дослідження здатності бактерій розщеплювати білки (протеолітичні вла­стивості) – молоко/середовище з желатином. Протеоліз у молоці виражається розчиненням згустка казеїну – згортає молоко.

Середовища із желатином готують на м'ясній воді, додаючи 1 % пептону, 0,5 % хлориду натрію та 10-20 % желатину. Посів роблять уколом. Протеоліз про­являється розрідженням стовпчика середовища. Пептолітичні властивості (здатність розщеплювати пептони – продукти неповного гідролізу білка) – МПБ, лептонна вода. Засівають м/о, потім визначають утворення кінцевих продуктів – аміак, сірководень та індол. Для знаходження аміаку в пробірку вставляють та при­тискають пробкою червоний лакмусовий папірець – синє забарвлення. Індикатор на сірководень – розчин ацетату свинцю, який за аналогічних умов визначення забарвлює фільтрувальний папір, змочений індикатором, у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю.

Індол вияв. смужкою фільтрувального паперу, змоченого 12 % розчином щавелевої кислоти – рожевий колір.

Метод Ерліха – пробкою пробірки притискають папірець, просякнутий спеціальним індикатором (спиртовий розчин парадиметиламідобензальдегіду). При наявності індолу колір його змінюється на бузково-рожевий або малиновий. В іншому варіанті визначення Індолу до 48-годинної бульйонної культури бактерій додають 1 -2 мл сірчаного ефіру, а потім — реактив Еріха. У нижній частині шару ефіру за 1-2 хв з'являється яскраве малинове кільце.

Є диференційно-діагностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва – виявляють розкладання лактози бактеріями. Дозволяють проводити первинну диференціацію бактерій кишкового тракту. Вони елективні для багатьох представників родини кишкових бактерій. Випускаються у сухому вигляді, їх приготування в лабораторіях не потребує багато часу.

Середовище Ендо – сухий живильний агар, 1 % лактози та індикатора фуксину, знебарвленого розчином сульфіту натрію. Свіже середовище – слабкорожеве. При рості лактозопозитивних м/о – колонії забарвлюються у темно-червоний колір з металевим блиском. Колонії лактозонегативних – безбарвні.

Середовище Левіна – МПА, лактоза, однозаміщений фосфат калію, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище – фіолетовий колір. Колонії лактозопозитивних бактерій – темно-синє забарвлення, а лактозонегативні – рожевий відтінок.

Сухий бактоагар Плоскирєва (Бактоагар Ж) – агар із солями жовчних кислот лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, фосфат натрію, брильянтовий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний червоний. М/о, що розщеплюють лактозу, - колонії рожевого кольору, протилежні – безбарвні.

Середовища Гісса – дослідження ферментації декількох цукрів – рідкі та напіврідкі.

Основа рідкого середовища – 1 % лептонна вода з 0,5 % натрію хлориду, 1 % вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та ін.), додають індикатор Андреде (кислий фуксин він розчині NaOH). Встановлюють рН 7,2 – жовтий колір. Середовища з різними вуглево­дами розливають в окремі пробірки, в які встановлюють поплавок – запаяну з одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см з відкритим кінцем донизу. Стерилізують парою під тиском 0,5 атм 15 хв.

Після посіву, якщо ферментують вуглеводи – червоне забарвлення – зміна рН у кислу сторону, деколи з поплавка витісняється рідина – утворення газу. Три варіанти: не ферментують субстрату/ бактерії розкладають вуглеводи з утворенням кислоти без газу чи кислоти і газу.

Набір сухих середовищ для визначення цукролітичних ферментів, з яких готують напіврідкі строкаті ряди. До їх складу входять індикатори ВР (суміш водно­го голубого з розоловою кислотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий пурпурний. При наявності газу спостерігаються бульбашки/розриви живильного середовища у товщі агару. При підкисленні середовища з Індикатором ВР воно стає синім, а при підлужнюванні — червоним (бромкрезоловий пурпурний при утворенні кислоти дає дещо фіолетове та лимонно-жовте забарвлення, а бромтимоловий синій - зеленкувате або лимонне). У лужному середовищі вони мають відповідно Інтенсивно фіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.

Сухі середовища Рессела та цукровий агар із сечовиною Олькеницького СР – напіврідкий агар із лактозою (1 %) і глюкозою (0,1 %) та індикатором ВР. Після розливання у пробірки, кладуть так, щоб утворився стовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею спочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії ферментують лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього середовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу – колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спостерігають за появою його бульбашок або розривами агару.

Трицукровий агар із сечовиною Олькеницького. Визначають ферментацію лактози, сахарози, глюкози, утворення сірководню та наявність у бактерій ферменту уреази. Вводять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексну сіль амоній-залізо сульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індикатор феноловий червоний. Блідо-рожевий колір.

Розщеплення цукрів – жовтий колір. Глюкоза наявна в невеликих концентраціях (0,1 %), в аеробних умовах (скошена поверхня) бактерії повністю утилізують її за перші години росту. Через 18-24 год вони споживають і пептони як білкову живильну основу. При цьому утворюється аміак, який робить середовище лужним, надаючи йому червоного кольору. Однак у стовпчику агару жовтий колір залишається, тому що там зберігаються кислі кінцеві продукти, які забезпечують низький рівень рН.

Ентеробактерії, які розкладають лактозу й глюкозу, підкислюють середовище в усій пробірці (жовтий колір стовпчика та скошеної поверхні). Оскільки лактози (1 %) в 10 разів більше, ніж глюкози, через 18-24 год інкубації її запаси ще невичерпані, зберігається жовтий колір середовища. Через 48 год – почервоніння (зсув рН у лужну сторону).

Якщо бактерії утворюють газ (вуглекислий, водень) при ферментації цукрів, з'являються розриви середовища або відбувається скупчення газу на дні, що піднімає агар у пробірці.

Сірководень мікроби утворюють з неорганічних сполук, завдячуючи ферменту тіосульфатредуктазі. Взаємодіють із сірководнем солі заліза, які, вступаючи з ним у реакцію, утворюють сульфід заліза у вигляді нерозчинного преципітату чорного кольору в стовпчику.

Уреаза руйнує сечовину з виділенням великої кількості аміаку, під впливом якого все середовище червоніє. При наявності уреазопозитивних штамів провести облік ферментації цукрів неможливо –використовують інші середовища.

Тест-системи для визначення різноманітних властивостей бактерій: "Roche", "API", "Enterotest", пластини та диски індикаторні біохімічні.

Гемолітична активність мікроорганізмів – кров'яний МПА. Готують з розтопленого та охолодженого до 45-50 °С живильного агару, додають 5-10% дефібринованої або свіжої крові тварини (барана або кролика). Агар з кров'ю перемішують, розливають у чашки Петрі. Якщо бактерії продукують гемолізини, навколо колоній або штрихів посіву утворюються зони просвітління на матовому червоному фоні. За кольором гемолізу (безбарвний, зеленкуватий) можна визначити тип гемолізинів (а, р, у тощо).

Ліполітичні властивості мікробів виявляють введенням ліпідів/жироподібних субстанцій – твін. Утворюються райдужні вінчики навколо колоній при розщепленні ліпідів.

Редукуючі властивості вивчають, додаючи до складу середовищ барвники (метиленовий синій, наприклад), які здатні відновлюватись. Фіксуючи час зміни кольору індикатора, можна судити про ступінь вираження редукуючоїактивності. Декарбоксилазну активність бактерій оцінюють на спеціальних середовищах з амінокислотами (лізином, орнітином, глютаміновою кислотою та їн.) і відповід­ними індикаторами.

Вивчають антигенну будову – ідентифікація за антигенними властивостями. Кожний мікроорганізм має у своєму складі різні антигенні субстанції. Представники родини ентеробактерїй (ешеріхії, сальмонели, шигели) містять оболонковий О-антиген, джгутиковий Н-антиген і капсульний К-антиген. Неоднорідні за своїм хімічним складом, тому існують у багатьох варіантах. їх можна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. Таке визначення виду бактерій носить назву серологічної ідентифікації. Найчастіше використовується орієнтовна реакція аглютинації на склі – на предметне скельце наносять різні діагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх антигенів), потім у кожну краплю вносять стерильною петлею невелику кількість чистої культури. За декілька хвилин спостерігають за феноменом аглютинації. Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збудника та антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційно­го агента. При наявності позитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера).

Ідентифікація за токсигенними властивостями мікробів – визначення токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем, просоченим антитоксичною сироваткою – + реакцію.

Провдять заражаючи лабораторних тварин чистою культурою, спостерігаючи змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо) – ідентифікацієя за біологічними властивостями. Як об'єкти — найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів.

Визначення чутливості до антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар, диско-дифузійний метод) – на поверхню спеціального щільного живильного середовища в чашках Петрі засівають культуру мікроорганізмів і накладають паперові диски, просочені різними антибіотиками. Посіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год, вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з антибіотиками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких штамів.

На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антиген­них, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію. Наприклад: "Виділено Escherichia coli" або "Виділений збудник належить до виду Staphylococcus epidermidis".