3.1.Изучите серологические реакции их значение для диагностики инфекционных заболеваний.

Серологические реакции – это такие реакции, для постановки которых используют сыворотку, содержащую антитела. В их основе лежит специфическое взаимодействие антитела с антигеном.

Серологические реакции применяют для идентификации микроорганизмов, токсинов, любого антигена с помощью известных иммунных диагностических сывороток и для определения природы антител в сыворотке крови с помощью известных антигенов – диагностикумов. При этом метод определения видовой принадлежности (идентификация) микробов называют серологическим типажем, а способ определения титра антител в сыворотке крови – серологической диагностикой.

Общие закономерности серологических реакций:

1. Реакции ставят in vitro (на искусственных питательных средах).

2. Реакции проявляются при иммунологическом соответствии антигена и антитела, в оптимальных температурных условиях и рН среды.

3. Реакции протекают в две фазы:

• Специфическая – взаимодействие антигена с антителом.

• Неспецифическая – образование комплекса антитело – антиген.

Основными серологическими реакциями являются:

• Реакции агглютинации

• Реакции преципитации

• Реакция связывания комплемента

• Реакции нейтрализации экзотоксинов и вирусов

• Методы, основанные на связывании меченых антигенов и антител (ИФА, иммунофлюоресцентные методы)

• Кожные пробы и провокационные тесты

В серологических реакциях решается обычно две задачи:

1. с помощью известной антисыворотки в биологических жидкостях выделяют антиген;

2. с помощью известного антигена в сыворотке крови определяют антитела.

Для выявления неизвестного антигена (микроорганизма, белка и др.) используют диагностические иммунные антисыворотки, которые получают путем многократной иммунизации лабораторных животных соответствующими антигенами.

Обнаружение антител проводят с использованием специальных антигенов - иммунодиагностикумов. Часто это взвесь известных убитых (инактивированных) микроорганизмов. При выделении из клеток различных антигенов используют методы разрушения, экстракции, обработку ферментами и различными детергентами, центрифугирование.

Задание № 4

4.1. Изучите принцип постановки и учёт результатов реакций агглютинации

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

В зависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латекс - агглютинации, коагглютинации и т.д.

Для диагностики инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух вариантах: определяют вид выделенного от больного микроба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки (серологическая идентификация микроба) и выявляют антитела в сыворотке больного, используя стандартный микробный диагностикум (серодиагностика заболевания, постановка серологического диагноза).

Реакция прямой агглютинации микробов (РА).

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены). Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации). По характеру образующегося агглютината различают зернистую и хлопьевидную агглютинацию. Зернистая агглютинация происходит при склеивании микробов, содержащих О - антиген. Бактерии, имеющие жгутики (Н-антиген), агглютинируются с образованием крупных хлопьев.

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки. Их получают гипериммунизацией лабораторных животных взвесью бактерий.

Варианты реакций агглютинации. Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА. Пластинчатую РА ставят на стекле. В этой реакции используют сыворотки с наибольшим разведением или не разведенные. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов.

Подготовительный этап:

1. Подготовить рабочее место согласно правил работы в серологической лаборатории.

2. Подготовить емкость с дез. раствором для обеззараживания предметов, используемых для постановки реакции, согласно инструкции.

Основной этап:

На стекло наносят каплю сыворотки, в которую петлей вносят неизвестную культуру бактерий, перемешивают и через 2-3 мин наблюдают появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации. Для контроля используют каплю физиологического раствора, в которой после внесения бактерий наблюдается помутнение. При использовании неадсорбированных сывороток реакция на стекле имеет только ориентировочное значение.

Развернутую РА проводят в пробирках или лунках планшет. При этом диагностическую сыворотку разводят до титра и вносят одинаковые количества антигена. При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок в виде «зонтика», при отрицательном – в виде «пуговицы». Поскольку титры группоспецифических антител в сыворотке значительно ниже, чем титр видоспецифических, групповые реакции наблюдаются лишь в небольших разведениях сыворотки. Если агглютинация происходит до титра или до половины титра сыворотки, она является видоспецифической.

Для определения антител в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум, содержащий взвесь известных микробов или их антигенов. В этом случае также можно ставить пластинчатую и развернутую РА.

Для определения групп крови используют стандартные сыворотки О, А, В групп с титром > 1:32 и контрольную АВ (IV) группы. При температуре 18-25ºС на планшет (тарелку) наносят по одной -две капли этих антисывороток, добавляют к ним в 8-10 раз меньшие капли крови из пальца или из пробирки и смешивают палочкой; осторожно покачивают в течение 3 мин. При наличии агглютинации добавляют по 1 капле 0,9 % р-ра хлорида натрия и учитывают результат через 5 мин. При отсутствии агглютинации во всех трех смесях – нет антигена (0, I), если агглютинация с сывороткой 0 (I) и В (III), то имеется антиген А – группа А (II), если агглютинация в сыворотке 0 (I) и А (II), если агглютинация в сыворотке 0 (I) и А (II), то имеется антиген В – группа В (III), наличие агглютинации во всех трех пробирках при отсутствии контрольной – АВ указывает на присутствие антигенов А и В – группа АВ (IV).

Применяется также проба на совместимость крови, когда капли крови донора и реципиента смешивают и оценивают агглютинацию.

В клиниках применяют реакции агглютинации лейкоцитов, тромбоцитов и др. клеток для выявления аутоантител, а также для определения антигенов на этих клетках.