6. Калориметрические измерения

Основные трудности калориметрических измерений связаны с интерпретацией экспериментальных кривых в условиях, когда термоиндуцированный переход в индивидуальных соединениях проходит в несколько стадий, а также при усложнении состава системы и формы калориметрической кривой.

Сравнительно простой оказывается интерпретация калориметрических кривых, описывающих одиночный термоиндуцированный переход в индивидуальном соединении. Это относится к микрокалометрическим кривым термоденатурации большого числа глобулярных белков, некоторых фибриллярных белков (например, проколлагена), ДНК и мембранных структур из индивидуальных (синтетических) липидов. Резко усложняется интерпретация многокомпонентных калориметрических кривых теплопоглощения в прогреваемых растворах индивидуальных РНК и ряда больших белков.

Биологические мембраны и их фрагменты - несравненно более сложный объект для калориметрических исследований. Трудности заключаются главным образом в невозможности однозначно интерпретировать струк-турные переходы, выделить их и определить энтальпию отдельного переходного процесса .

Результаты микрокалориметрических имерений можно проиллюстриро-вать на примере простого и подробно изученного процесса - денатурации глобулярного белка лизоцима. Типичная экспериментальная калориметри-ческая кривая приведена на Рис. 5.

Рис. 5

Типичная экспериментальная калориметрическая кривая процесса денатурации лизоцима (а) и базовая линия с калибровочной меткой, полученная при заполнении обеих ячеек растворителем (б).]

Наряду с микрокалориметрической записью прогреваемого раствора лизоцима (1,6 мг мл, рН 4,5) приведена базовая линия с калибровочной меткой, полученная при заполнении обеих камер растворителем. Из рисунка видно, что теплоемкость раствора белка значительно ниже теплоемкости растворителя. По снижению линии записи от базовой линии рассчитывают парциальную теплоемкость белка при любой температуре с учетом того, что

,

где и - парциальные теплоемкости белка и растворителя; - масса белка в ячейке; - масса вытесненного им растворителя. Так-как

,

где и парциальный объем белка и растворителя соответственно, то

.

Этот метод позволяет получить температурную зависимость теплоем-кости нативного белка ниже области перехода; температурную зависимость теплоемкости денатурированного белка и разницу теплоемкостей нативного и денатурированного состояний в точке перехода: .

Как видно из термограммы в области 70°С развивается интенсивное теплопоглощение, связанное с денатурацией белка. По площади денатурационного пика, ограниченного снизу экстраполированными значениями теполоемкости нативного и денатурированного белка,

Можно рассчитать теплоту денатурации имеющегося в калориметре белка, а затем и удельную и молярную энтальпию денатура-ции: = М , где М – молекулярная масса белка.

Сложности при работе с биологическими мембранами (или их фрагментами) заключаются, главным образом, в невозможности одназначно интерпретировать регистрируемые структурные переходы в терминах термодинамики, определить энтальпию отдельных структурных переходов. Вопрос математической обработки термограмм биологических мембран остается пока открытым. В большинстве исследований, посвященных изучению тепловых эффектов вмембранных системах при температурном сканировании, сделаны попытки качественно связать тот или иной максимум на термограммах с участием тех или иных молекулярных компонентов мембран. При этом обычно полагают, что термообратимые переходы затрагивают липидные компоненты мембран. Важный метод идентификации термотропных переходов – выяснение характера влияния разнообразных внешних факторов на результаты экспериментов.

Метод сканирующей микрокалориметрии несомненно является перспективным также для выяснения механизмов термостабилизации и принципов повышения устойчивости биологических систем к экстремальным температурам.