2.2 Реактивы

– 2 %-ный раствор растворимого крахмала. Навеску растворимого крахмала берут из такого расчета, чтобы в 100 мл раствора содержалось 2 г сухого крахмала.

Взвешенную на технических весах навеску крахмала без потерь переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды и перемешивают, затем добавляют еще 25 мл и помещают колбу в кипящую водяную баню, выдерживая её до полного растворения крахмала и непрерывно помешивая раствор. Содержимое колбы охлаждают до 20 °С, добавляют 10 мл буферного раствора, доводят водой до метки и перемешивают;

– буферный фосфатный раствор (рН 4,8…4,9) – для анализа солода;

– буферный ацетатный раствор (рН 4,7…4,8) – для анализа ферментных препаратов, продуцированных плесневыми грибами;

– 1 н раствор соляной кислоты;

– 30 %-ный раствор сульфата цинка;

– 15 %-ный раствор раствора гексациано-(II)-ферроата калия (K₄Fe(CN)₆).

– солодовая вытяжка – взвешивают на технических весах две навески измельченного солода – одну для определения влажности и вторую для определения осахаривающей активности солода. Величина навески просяного солода 10 г, ячменного, овсяного и ржаного 5 г. Навеску количественно переносят в химический стакан или коническую колбу на 200…250 мл, добавляют 10 мл буферного фосфатного раствора (рН 4,8…4,9) и 90 мл дистиллированной воды.

Полученную смесь выдерживают в течение 60 минут при 30 ^оС, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтруют и фильтрат используют в качестве основного раствора для определения осахаривающей активности солода. Для проведения ферментативной реакции готовят рабочий раствор, пользуясь данными таблицы 1.

– основной раствор ферментного препарата – в стаканчике вместимостью 25…30 мл взвешивают 0,1 г исследуемого препарата. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой, добавив немного воды, затем количественно переводят в мерную колбу на 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и при необходимости фильтруют через складчатый фильтр. Прозрачный основной раствор ферментного препарата может храниться в течение 1 суток при температуре от +2 до -40 С;

– рабочий раствор ферментного препарата готовят, разбавляя основной раствор так, чтобы в 5 мл содержалось количество фермента, достаточное для гидролиза 20…70 % крахмала в принятых условиях. Количество основного раствора препарата, которое необходимо взять для приготовления рабочего раствора, находят по таблице 2.

2.3 Проведение анализа

Все пипетки, используемые при испытании, должны иметь ватные тампоны.

Для анализа берут 2 колбы. В них наливают по 40 мл 2 %-ного раствора картофельного крахмала (субстрат) и помещают в термостат с температурой 50 ± 0,5 ^оС. Выдерживают 5…10 минут, одновременно выдерживают в термостате рабочий раствор фермента.

К раствору крахмала добавляют 20 мл рабочего ферментного раствора, доведенного до той же температуры, перемешивают и выдерживают при 50 ^оС 30 минут. По истечении этого времени колбу с содержимым вынимают из термостата и добавляют в нее 2 мл термостатированного 1 н раствора соляной кислоты для инактивации фермента. Для осаждения белков и осветления приливают 2 мл 30 %-ного раствора сульфата цинка, а после перемешивания – 2 мл раствора гексациано-(II)-ферроата калия (K₄Fe(CN)₆) (15 %-ного).

Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в другую колбу наливают последовательно 20 мл ферментного раствора, 2 мл 1 н раствора соляной кислоты, по 2 мл растворов сульфата цинка и гексациано-(II)-ферроата калия и 40 мл субстрата.

Содержимое обеих колб фильтруют. В фильтратах (контрольном и испытуемом) определяют поляризацию на сахариметре любой марки в поляризационной кювете длиной 200 мм. После измерения получают значения поляризации: Пк (контрольный раствор) и По (исследуемый, опытный раствор). Разность между значениями величины угла вращения плоскости поляризации контрольного и исследуемого растворов (ΔП) показывает снижение степени поляризации, которое пропорционально количеству образовавшихся в процессе ферментативной реакции низкомолекулярных углеводов.

Значение ΔП должно быть не менее 0,2^о и не более 2,5^о при определении на поляриметрах с нормальной сахарной шкалой.

Осахаривающую активность (ОС_п, ед./г) определяют по уравнению (7)

(7)

где а – масса солода в реакционной среде, мг;

0,050 и 0,0114 – постоянные коэффициенты, выведенные на основе экспериментальных данных.

Допустимые отклонения в параллельных определениях должны составлять не более 1,0 %.

При анализе концентрированных препаратов и поверхностных культур плесневых грибов применяют формулу (8)

(8)

где а – масса ферментного препарата в реакционной среде, мг,

при анализе глубинной культуры формулу (9)

(9)

где V – количество ферментного препарата в реакционной среде, мл,

0,051; 1; 0,0102 – постоянные коэффициенты, выведенные на основе экспериментальных данных.