1. От чего зависит функция фотосинтеза?

2. Как осуществляют отбор листьев для исследования?

3. Методика определения процента повержденной ткани листа.

Лабораторная работа 5

Уменьшение содержания хлорофилла в листьях растений в результате антропогенного и техногенного воздействия

Цель работы ‑ определения хлорофилла в листьях растений, находящихся в условиях техногенной нагрузки, фотометрическим методом.

Количество хлорофилла (по сырой или сухой массе) колеблется от 0,08 до 0,14 мг/г или от 0,3 до 1,3 % абсолютно сухой массы листа (насаждения сосны). Данные относительно использования содержания хлорофилла (и других пигментов) как биоиндикационных признаков, в научной литературе противоречивы. Ряд немецких ученых считает этот признак недостаточно информативным и специфичным, хотя первой стадией видимых хлорозов листьев как раз и является разрушение хлорофилла под влиянием неблагоприятных факторов. В то же время отечественные исследователи показали, что у чувствительных к загрязнению видов (липы, клена) наблюдается снижение содержания хлорофилла еще до появления видимых изменений и это биоиндикационным признаком.

Неспецифичность этого индикатора в том, что недостаток в почве азота, железа и других элементов, быстро сказывается на окраске листьев в результате разрушения хлорофилла в них и, этот признак очень часто используется для оценки низкого плодородия почв. Это надо учитывать и использовать этот показатель при биоиндикации в сочетании с другими признаками.

Для оценки степени загрязнения наземных экосистем или их составляющих листья собирают из средней части кроны в первой половине вегетации, учитывая условия произрастания (освещенность, минеральное питание, обводненность и др.). В качестве биоиндикаторов в городской среде рекомендуется использовать следующие газочувствительные виды: липу мелколистную, клен платанолистый, каштан конский, ель обыкновенную, сосну обыкновенную.

Метод основан на извлечении хлорофилла из листьев растворителями (спирт, ацетон) и определении его количества на фотоэлекроколориметре или спектрофотометре. Для учебной работы можно использовать и комнатные растения, выращенные специально в сосудах на гумусной почве с поливом водой и на малоплодородной почве с поливом раствором соли какого-либо тяжелого металла.

Оборудование, реактивы, материалы:

Весы; фотоэлектроколориметр ‑ ФЭК; насос Камовского или электрический; колба Бунзена с пробкой и стеклянным фильтром № 2, № 3 (в случае отсутствия колбы Бунзена, стеклянных фильтров и насоса, их можно заменить центрифугированием вытяжки хлорофилла); ступки малые с пестиками; стеклянные палочки; ножницы; толченое и просеянное стекло; мерные колбы на 100 и 50 см³; калька; вазелин; фильтровальная бумага; медный купорос CuSО₄ 5Н₂О; биохромат калия К₂Сr₂O₇, 7%-ный раствор аммиака; листья растений-индикаторов, собранные в "загрязненной" и "чистой" зонах.

Порядок выполнения работы:

1. Определение хлорофилла в листьях можно проводить как на свежем, так и на фиксированном материале. Фиксацию осуществляют текучим паром (5 мин) или сухим жаром (при 105⁰С в течение 5-10 мин).

2. Листья нарезают мелкими кусочками, заворачивают в марлю и погружают в кипящий насыщенный раствор поваренной соли на 1-2 минуты. За это время материал обезвоживается и ферменты убиваются.

3. Затем материал промывают текучей водой в течение 0,5 минуты, встряхивают для удаления влаги. Высушивают в тени не менее 2-х суток или в термостате при температуре не выше 40⁰С.

4. При работе с сухим материалом берут навеску 0,5-1 г, со свежим - 1-2 г. Предварительно определяют влажность листьев. Навеску растительного материала (исключая жилки) тщательно измельчают в фарфоровой ступке с битым стеклом, добавляя мел или углекислый магний. Извлечение хлорофилла из сухого материала можно производить 90 %-ным спиртом или 80-85 %-ным ацетоном, а из свежего ‑ 96-98 %-ным спиртом или абсолютным ацетоном.

5. К растертому растительному материалу прибавляют немного растворителя, и материал продолжают растирать вместе с растворителем.

6. В колбе Бунзена в отверстие пробки укрепляют стеклянный фильтр № 2 или № 3 (диаметр фильтра должен соответствовать количеству исследуемого материала). Колбу соединяют с насосом и производят отсасываниё жидкости. Жидкость из ступки сливают по стеклянной палочке в воронку-фильтр, предварительно смазав вазелином снаружи носик ступки. В ступку приливают 4-5 см³ растворителя и вновь растирают в течение минуты, затем опять сливают в воронку. Эту манипуляцию повторяют 2-3 раза, затем переносят на фильтр всю растертую массу, уплотняют ее палочкой и отсасывают. Ступку ополаскивают несколько раз растворителем, выливая его на уплотненный материал в воронку, где ему дают постоять 2-3 минуты, после чего отсасывают. Промывание ведут до тех пор, пока стекающий раствор не станет бесцветным.

7. Затем экстракт переносят в мерную колбу на 50 см³, ополаскивая несколько раз, промывают колбу Бунзена и выливая в мерную. Вытяжку доводят до метки растворителем.

8. Колориметрирование раствора производят на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. Если жидкость окрашена в интенсивно зеленый цвет, ее необходимо разбавить, так как больших концентрациях величины на ФЭКе могут выходить за пределы разрешающей способности прибора.

9. Для пересчета хлорофилла на стандартные величины используют раствор Гетри, который готовится следующим образом: 1) 1 %-ный раствор CuSO₄ 5H₂O (берут синие кристаллы), 2) 2 %-ный раствор K₂Cr₂O₇, 3) 7 %-ный раствор аммиака (на 7 см³ 18 %-ного аммиака надо взять 11 см³ воды). Для изготовления стандарта в мерную колбу емкостью 100 см³ точно отмеривают растворы (CuSO₄ 5H₂O – 28,5 см³, K₂Cr₂O₇ – 50 см³, аммиака – 10 см³), доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор Гетри по окраске колориметрически эквивалентен раствору кристаллического хлорофилла по содержанию последнего 85 г в дм³;

10. Методом разбавления стандартного раствора строят калибровочную кривую, где по оси абсцисс откладывают содержание хлорофилла (г/дм³), а по оси ординат ‑ оптическую плотность. Калибровочную кривую строят от концентрации 0,085 г/дм³ (1 см³ исходного раствора и 99 см³ воды) до 7,65 г/дм³ (90 см³ исходного раствора и 10 см³ воды).

По полученным данным определяют концентрацию хлорофилла в опытных образцах по калибровочной кривой (С_хл, мг/дм³). Затем вычисляют количество хлорофилла в 50 см³ экстракта (С_хл50, мг) по формуле:

, (5)

Затем вычисляют количество хлорофилла в мг/г листа (С_{хл вес}) и в % (С_хл%) (по сырой или сухой массе) по формулам.

, (6)

где m – масса растительного материала по сухому или сырому весу, г.

. (7)

Схема записи результатов анализов

№	Навеска листьев, г	Показания ФЭКа	Количество хлорофилла		Содержание хлорофилла в листьях
			по калибровочной кривой, г/дм3	г в 50 см3	г/кг (мг/г)	%

Вопросы для самоподготовки:

1. Какое количество хлорофилла (по сырой или сухой массе) содержится в абсолютно сухой массе листа?

2. Какие газочувствительные виды деревьев рекомендуется использовать в качестве биоиндикаторов в городской среде?

3. Принцип метода определения концентрации хлорофилла в листьях?

4. Какие виды деревьев чувствительных к загрязнению?

5. С помощью какого вещества моделируют раствор хлорофилла при построении калибровочной кривой?