Очистка pDna равновесным центрифугированием в CsCl.
Адаптированная методика для центрифуги Optima TL-100 (Beckman). Используется бакет-ротор, пробирки запаивать не нужно. Удобна, когда требуется не слишком большое количество (до 1mg) pDNA высокого качества.
Растворы.
p1,p2,p3
Изопропанол/CsCl
Комментарии.
Общие.
По пунктам.
взять 0.2-1.0mg pDNA, довести объём до 540µl (H2O или TE),
добавить
0.800g CsCl;
60µl EtBr 10mg/ml;
смешать, NT, 5';
ЦФ NT, 10';
перенести водную фазу в полипропиленовую ультроцентрифужную пробирку для ротора TLS-55; наслоить поверх последовательно по 0.73ml растворов "p2" и "p1";
уравновесить пробирки (вместе с бакетами) попарно на точных весах (с точностью до 1mg);
ЦФ на Optima TL-100 (Beckman) 55krpm, NT, >12h (лучше ~24h);
собрать в 1-2ml шприц суперскрученную pDNA (нижняя полоса), перенести в 1.5ml пробирку;
несколько раз (до исчезновения окраски) экстрагировать раствором "изопропанол /CsCl";
очистка от CsCl:
либо диализ,
либо разбавить H2O в 3 (а лучше в 6) раз и осадить 1х объёмом EtOH (мягко смешать, преципитат промыть 75% EtOH, дважды перенося типом в новую пробирку);
подсушить, растворить в H2O или TE, спектрофотометрически определить концентрацию.
Комментарии.
Общие.
При очистке pDNA на центрифуге Optima TL-100, ротор TLS-55 имеет смысл преформировать ступенчатый градиент CsCl, т.к.
время установления градиента концентрации CsCl без преформирования ~65h;
время установления градиента концентрации CsCl с преформированием ~ 8h;
время миграции молекулы DNA вдоль градиента ~11h.
В зависимости от того, от чего важнее очистить DNA (от белков+никованной DNA или от RNA), pDNA вносится либо только в верхнюю, либо только в нижнюю ступень градиента. При таком внесении примесям не приходиться проходить через плотный слой pDNA и их отделение происходит быстрее и качественнее.
По пунктам:
п. 1.
pDNA смешивается с CsCl и EtBr. EtBr интеркалирует в двухцепочечную молекулу DNA, при этом происходит некоторое раскручивание спирали. В линейную молекулу dsDNA (или никованную кольцевую) краситель может входить без всяких проблем, связанных с раскручиванием. С кольцевой ковалентно замкнутой начинаются проблемы, связанные с перекручиванием спирали (красителя связывается меньше). Интеркаляция EtBr вызывает понижение плотности DNA, следовательно, линейная и никованная DNA оказываются легче, чем кольцевая ковалентно замкнутая. За счет этого и происходит их разделение.
EtBr играет и еще одну роль. Его интеркаляция меняет геометрию DNA и это помогает снять с нее тесно ассоциированные белки. Существуют методы выделения DNA, где EtBr используется только в этой роли (без всякого ультроцентрифугирования).
п. 4.
Этот этап позволяет избавиться от белков, которые выпали в осадок в высокосолевом растворе. Отбирая водную фазу, постарайтесь не разрушить белковый преципитат. Лучше, если удастся прилепить его к стенке пробирки.
п. 5.
При очистке векторной pDNA более важно очиститься от примесей RNA (они мешают дефосфорилированию)=> pDNA вносится только в нижнюю ступень градиента (RNA опускается вниз, а DNA поднимается вверх).
п. 6.
Центрифуга будет нормально работать и при точности ~10mg, но с весьма заметным свистом. При точности ~1mg она будет работать совершенно бесшумно (если не считать лёгкого пыхтения форвакуумного насоса).
п. 9.
"Изопропанол/CsCl" по нашему опыту лучше и удобней, чем такие способы удаления EtBr, как экстракция бутанолом или использование ионообменной смолы. То, что смесь трехфазная, позволяет избежать обезвоживания раствора DNA (что чревато выпадением в осадок DNA и соли).
На самом деле (особенно при очистке вязких растворов, когда приходится делать несколько экстракций) некоторое обезвоживание всё же происходит. Поэтому удобно маркером отметить на пробирке уровень водной фазы и добавлять "на глаз " mQ до этой отметки после каждой экстракции.
п. 10.
Преципитация при NT (не на -20oС!, иначе CsCl выпадет в осадок).
Есть сообщение, что если разбавить раствор в большее количество раз, то выход pDNA выше.