Классификация

Существует несколько систем классификации плазмид базирующихся на:

• топологии (линейные или кольцевые),

• механизмах репликации (см. выше),

• маркерных генов, содержащихся на плазмидах (например: устойчивость к антибиотикам, гены биодеградации ксенобиотиков, системы рестрикции — модификации, гены синтеза бактериоцинов и т. д. — или полному отсутствию оных — криптические плазмиды),

• круге хозяев,

• копийности,

• совместимости,

• конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные.

Вне зависимости от типа, все плазмиды содержат точку инициации репликации (ori V).

Функции в клетках

Присутствие плазмид в клетках может быть объяснено преимуществами, которые дают плазмидные гены клетке-хозяину (возможность расти в присутствии антибиотика, использование более широкого круга субстратов, защита от бактериофагов, устранение конкурентов путем синтеза бактериоцинов) или же теорией эгоистичной ДНК, как в случае криптических плазмид (т. е. плазмида поддерживается благодаря своей приспособленности к условиям внутри клетки).

Выделение плазмидной днк из дрожжей на колонках.

Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из дрожжей на колонках для последующей трансформации E.coli или проведения PCR.

Растворы.

• Tris/Сорбитол

• I плазмидный раствор

• II плазмидный раствор

Комментарии.

• Общие.

• По пунктам.

1. Посеять одиночную колонию в 3ml селективной среды и растить не менее 20h при +30°С;

2. 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 3', удалить супер;

3. Суспендировать осадок в 300µl раствора "Tris/Сорбитол";

4. Добавить 5 µl литиказы (10u/µl);

5. 37°С, 1h, время от времени перемешивать;

6. ЦФ 3', удалить супер;

7. Суспендировать осадок в 50µl "I" плазмидного раствора;

8. + 100µl "II" плазмидного раствора, ~3 раза перевернуть;

9. 0oС, 5';

10. + 50µl холодного 10М AcONH4, ~3 раза перевернуть;

11. 0oС, 5';

12. ЦФ 10', супер перенести в новую пробирку;

13. К суперу добавить 800µl "Capture buffer"

14. Поместить колонку в 2ml пробирку;

15. Нанести на колонку 500µl из п.13, ЦФ 1';

16. Нанести на колонку оставшиеся 500µl из п.13, ЦФ 1';

17. Нанести на колонку 500µl "Wash buffer", ЦФ 1';

18. Поместить колонку в чистую 1.5ml пробирку;

19. Нанести на колонку 20-50µl 10mM Tris-HCl pH=8.0, инкубировать 2';

20. ЦФ 20'', элюат перенести в новую пробирку.

Комментарии.

Общие.

• Плазмидная ДНК, выделенная этим методом, не имеет особого загрязнения геномной ДНК и РНК, но концентрация ее очень мала. Тем не менее, ее вполне достаточно для химической трансформации E.coli. Если трансформировать 5µl выделенной плазмиды, то вырастает обычно около сотни колоний.

• Плазмида также годится для проведения PCR.

По пунктам.

п. 1.

• Мы обычно растим дрожжи в SD среде с необходимым набором аминокислот. Если необходимо, с добавлением антибиотиков. В богатой среде YPD можно растить только те плазмиды, которые достаточно стабильны и не теряются в процессе роста дрожжей.

п. 4.

• Литиказа (Sigma, #L4025) разрушает клеточную стенку дрожжей.

п. 13.

• Мы используем стекловолоконные колонки фирмы Amersham (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, #27-9602-01). Можно также использовать кит фирмы Qiagen или любой аналогичный.

п. 14.

• Пробирка берется такая, что бы уровень жидкости после центрифугирования в пунктах 15, 16,17 не касался нижнего края колонки. Можно использовать 2ml пробирки с завинчивающейся крышкой или пробирки из кита.

п. 15,16,17.

• После каждого пункта, удалять жидкость, прошедшую через колонку.

п. 20.

• Элюат - это то, что сошло с колонки.