1.5.Пространственное строение активного центра ферментов

В настоящее время накоплен достаточно большой экспериментальный материал (в основном данные рентгено-структурного анализа), позволяющий сделать ряд важных выводов об общих закономерностях пространственного строения активного центра ферментов. Но прежде рассмотрим механизм действия и конформацию активного центра двух конкретных ферментов — пищеварительного фермента эластазы (сериновой протеазы), осуществляющего гидролиз полипептидов, и рибонуклеазы А (эндонуклеазы), гидролизующей рибонуклеиновые кислоты. Оба фермента состоят из оной полипептидной цепи и не содержат кофермента.

Эластаза (240 аминокислотных остатков) катализирует реакцию:

В растворе гидролиз амидов проходит как одноступенчатая реакция с прямой атакой воды на карбонильную группу (нуклеофильное присоединение к карбонильной группе, Ad_N). Для эффективного протекания реакции необходим либо кислый, либо основный катализ. При катализе сериновыми протеазами реакция разбивается на две последовательных стадии (Рис. 5 .35). На первой стадии (Рис. 5 .35) карбонильная группа расщепляемого пептида атакуется кислородом гидроксигруппы серина. Соседство с протонированным имидазольным кольцом гистидина, протонирование которого обеспечивается близким расположением карбоксильной группы остатка аспарагиновой кислоты, существенно повышает стабильность ионизованной формы гидроксила остатка серина (за счет электростатической энергии притяжения зарядов). В значительной части молекул фермента этот гидроксил находится в виде аниона, что резко повышает его нуклеофильную активность. В результате атаки аниона пептидная связь разрывается и одна часть пептида покидает активный центр фермента серинового, а другая переносится на остаток серина с образованием ацилфермента. На второй стадии катализа (Рис. 5 .35) промежуточно образовавшийся сложный эфир гидролизуется при действии воды и активный центр освобождается для проведения следующего акта катализа (Рис. 5 .35).

Рис. 5.35. Механизм гидролиза пептидной связи сериновыми протеазами.

Такой тип катализа принято называть нуклеофильным.

Кроме каталитических групп в активеном центре существует “карман” для связывания бокового радикала аминокислотного остатка. Пространственное строение этого кармана определяет специфичность сериновых протеаз к аминокислотной последовательности гидролизуемого полипептида и удерживает этот полипептид в нужной ориентации относительно каталитических групп. Эластаза расщепляет преимущественно пептидную связь между остатком, содержащим в боковом радикале удаленный от ативного центра положительный заряд (этому условию удов-летворяют остатки лизина и аргинина) и следующим аминокислотным остатком (напомню, что выбранным направлением полипептидной цепи является направление от N- к С-концу).

Важно отметить, что активный центр формируется не одним участком полипептидной цепи фермента, а пептидными петлями, принадлежащими совершенно разным участкам белковой молекулы.

В случае эластазы эти участки расположены недалеко от начала (His 57), середины (Asp 102) и конца (Ser 195) полипептидной цепи фермента. Это явление, поначалу кажущееся удивительным, достаточно очевидно из общих соображений. Поскольку конформационные возможности полипептидной цепи весьма ограничены, организация активных центров, пространственно комлементарных тысячам субстратов с совершенно разным очертанием внешней поверхности, практически невозможно. Эту задачу можно решить лишь «блочным» методом, где каждый строительный блок принадлежит разным участкам полипептидной цепи.

Полная третичная структура эластазы приведена на Рис. 5 .36.

Рис. 5.36. Третичная структура эластазы и «укладка» в ней модели субстрата — N–глицил-лизил-аланил-глицина

Второй из рассматриваемых ферментов (рибонуклеаза А) гидролизует рибонуклеиновые кислоты. Реакция протекает в два этапа. На первом этапе (Рис. 5 .37, вверху) происходит расщепление фосфатной связи. Реакция протекает по механизму нуклеофильного присоединения к фосфатной группе (гетероаналог карбонильной группы). В качестве нуклеофильного агента выступает 2-гидроксил рибозы. Имидазольное цикл His 12 осуществляет основной катализ, акцептируя протон и тем самым резко увеличивая нуклеофильную активность кислорода (при этом он превращается в сопряженную кислоту). С другой стороны имидазол His 119 осуществляет кислый катализ, отдавая протон кислороду фосфатной связи превращаясь при этом в сопряженное основание. В результате фосфатная связь разрывается и образуется 2,3-циклофосфат, а свободная электронная пара с азота His 12 перемещается на азот His 119. После этого аденозин и присоединенный к нему остаток полинуклеотида покидают активный центр.

На втором этапе (Рис. 5 .37, внизу) протекает гидролиз промежуточно образующегося циклофосфата. В этом случае нуклеофильным агентом является молекула воды.

Основной катализ осуществляет His 119, а кислый — His 12. По окончании реакции активный центр возвращается к исходному состоянию и после ухода расщепленного субстрата фермент готов к новому каталитическому акту.

Рис. 5.37. Механизм гидролиза межнуклеотидной фосфатной связи рабонуклеазой А

Как плоская схема активного центра выглядит в трехмерном пространстве (по данным рентгено-структурного анализа) показано на Рис. 5 .38.Рис. 5 .38. Трехмерная структура активного центра рибонуклеазы А по данным рентгено-структурного анализа. Для удобства показаны лишь участки полипептидной цепи несущие связывающие и каталитические группы. Полипептидые цепи представлены ходом пептидного остов (темно-серые), связывающие и каталитические группы — палочковыми моделями (светло-серые), модель субстрата [уридилил(35)аденозин] — черной палочковой моделью. Водородные связи обозначены пунктиром. Для удобства приведены лишь участки полипептидной цепи, непосредственно участвующие в построении активного центра. На Рис. 5 .39 видно, как уложена молекула субстрата в третичной структуре белка. Отметим две важные особенности активного центра.

Во-первых, как и в случае эластазы «блочная» топология активного центра. В организации активного центра участвует начало (Gln 11, His 12), середина (Thr 45) и конец (His 119, Phe 120 и Ser 123) полипептидной цепи фермента.

Во-вторых, многоточечное связывание субстрата (в случае рибонуклеазы А — семь точек связывания: шесть водородных связей и гидрофобный контакт урацила с бензольным кольцом фенилаланина).

Рис. 5.38. Трехмерная структура активного центра рибонуклеазы А по данным рентгено-структурного анализа. Для удобства показаны лишь участки полипептидной цепи несущие связывающие и каталитические группы. Полипептидые цепи представлены ходом пептидного остов (темно-серые), связывающие и каталитические группы — палочковыми моделями (светло-серые), модель субстрата [уридилил(35)аденозин] — черной палочковой моделью. Водородные связи обозначены пунктиром.

На этом феномене остановимся подробнее. Именно многоточечное связывание обеспечивает высокую регио- и стереоспецифичность ферментов.

Рис. 5.39. Укладка субстрата [аденилил(35)уридилил(35)аденилил(35) аденозина] в третичной структуре фермента.

Одним из примеров региоспецифичных ферментативных реакций является обсуждавшийся выше гидролиз РНК рибонуклеазой А. В результате реакции фосфат всегда остается на 3-гидроксиле рибозы. Как хорошо видно из схемы на этом рисунке, региоспецифичность обеспечивается точной ориентацией гидролизуемого циклофосфата относительно катализирующих групп. Если бы субстрат мог вращаться в активном центре или колебаться с достаточно большой амплитудой, гидролиз приводил бы к смеси 2- и 3-фосфатов.

Из общих соображений очевидно, что для проявления стереоселективности необходимо как минимум три точки связывания (закрепление в пространстве трехмерного объекта).