1.5.3 Метод агаровых блоков

Метод агаровых блоков чаще всего применяется при изучении антагонистических свойств микроорганизмов. Его преимуществом является возможность культивирования микроорганизмов-антагонистов и тест-культур на разных по составу плотных питательных средах. Исследуемый на антагонистическую активность микроорганизм засевают на поверхность агаризованной среды в чашке Петри так, чтобы в процессе роста сформировался сплошной газон. Для этого можно использовать, к примеру, суточные культуры бактерий или дрожжей, споровые суспензии мицеллиальных грибов или актиномицетов (бактериологической петлей споры переносят в 1 мл стерильной воды), распределяя по 0,1–0,2 мл этих суспензий шпателем по всей поверхности среды. Посевы инкубируют при подходящей температуре 8–10 суток.

Затем стерильным пробочным сверлом (диаметр 6–8 мм) из слоя среды вырезают агаровые блоки и переносят их на поверхность агаризованной среды, только что засеянной тест-организмом. Тест-организм в виде суточной культуры чаще также засевают шпателем на поверхность плотной среды (метод Коха), но для улучшения диффузии антимикробного вещества можно использовать и глубинный посев в полужидкую агаризованную среду. Агаровые блоки размещают ростом (газоном) вверх, на равном удалении друг от друга и от краев чашки, плотно прижимая к агаровой пластинке. На агаровой пластинке в одной чашке Петри можно разместить 4–5 агаровых блоков с различными продуцентами антимикробных веществ.

Посевы выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре для диффузии антимикробных веществ в агар, а затем помещают в термостат для инкубирования тест-культур. Если тест-культура чувствительна к антимикробному веществу, которое продуцирует микроб-антагонист в составе агарового блока, то после инкубирования вокруг этого блока сформируется зона задержки (ингибирования, отсутствия) роста. Чем больше выделяется антимикробного вещества и чем оно активнее, тем будет больше ширина зоны задержки роста тест-организма. Тест-культура, не чувствительная к антимикробному веществу данного продуцента, растет в непосредственной близости от агарового блока продуцента.

Данный метод позволяет в одной чашке Петри исследовать чувствительность одной тест-культуры по отношению к нескольким антагонистам в составе агаровых блоков. Однако при необходимости можно модифицировать условия эксперимента с тем, чтобы получить возможность определения чувствительности нескольких тест-организмов по отношению к одному антагонисту. Для этого, например, в центр агаровой пластинки в чашке Петри помещают агаровый блок с газоном антагониста (ростом вверх), а через 30–60 минут (это время необходимо для диффузии антимикробного вещества в агар) по радиусам равномерными штрихами подсевают тест-культуры [19].

1.5.4 Методы оценки адаптации бактерий к антимикробным веществам

Выделение активируемых форм клеток и контроль за изменением уровня их чувствительности и устойчивости к антимикробным веществам обеспечивается использованием методов выращивания микроорганизмов в агаре.

Для достижения вышеизложенной цели зачастую используются методы культивирования микроор­ганизмов в жидких и агаризованных средах в присутствии антисептиков. Для реализации данных методов в суспензию клеток микроорганизмов в питатель­ном бульоне вносят антимикробные вещества. Далее суспензию поме­щают в термостат при 30°С и культивируют в течение 3 сут. Каждые сутки отбирают образцы и высевают их на ПА для определения количе­ства выживших клеток.

При выращивании микроорганизмов на агаризованных средах с антисептиками прово­дят последовательный пересев колоний кле­ток, появившихся на питательном агаре (ПА) с биоцидными веществами умеренной концен­трации, на среды с возрастающей концентраци­ей антисептика. Для этого готовят чашки Петри с плотной агаризованной средой с со­держанием биоцидов и контроль­ные чашки без биоцидов. В каждую чашку вно­сят суспензию микроорганизмов и культиви­руют в термостате при 30°С в течение 3 суток, а затем подсчитывают количество выросших ко­лоний клеток, устойчивых к биоцидам.

Для получения вторичной и последующих культур клеток из чашек Петри, на которых был отмечен рост микроорганизмов, отбирают отдельные колонии клеток, вносятих в фи­зиологический раствор, выравнивают концен­трации по оптической плотности и высевают разведения на чашки с ПА, содержащими такие же и возрастающие концентрации биоцидов.

Полученные на разных стадиях пересевов клетки используют для оценки чувствитель­ности и устойчивости микроорганизмов к биоцидным веществам. Эти измерения проводят с помощью метода диффузии веществ в агар. На поверхность застывшего ПА наносят суспензию тест-культуры микроорга­низмов и равномер­но распределяют с помощью стерильного шпа­теля по поверхности агара. Затем укладывают стерильные диски фильтровальной бумаги диаметром 8 мм, пропитанные в растворах биоцидов. Чашки помещают в термостат при температуре (30 ± 1)°С на 24 ч. После инкубирования изме­нют диаметры зон задержки роста клеток вокруг дисков.

При оценке чувствительности и устойчивости клеток микроорганизмов к биоцидам используют также метод реплик. Вырос­шие колонии клеток переносят из чашек без биоцидов на питательный агар с возрастающим содержанием антисептика и определяют преде­льные концентрации, при которых не наблю­далось образование видимых колоний клеток.

В качестве антисептиков применяют препараты полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ), хлоргексидин биглюконат (ХГ).

Для обработки результатов измерения используют статистические методы.

Скорость адаптации клеток на популяционном уровне можно оценить по тангенсу угла наклона полученных в ходе анализа зависимостей изменения логарифма численности клеток от времени их культивирования по формуле:

v = d (log N) / dt, (4)

где N – численность культивируемых микроор­ганизмов, устойчивых к биоциду;

t – время культивирования клеток.

Предложенные методы устанавливают, что длительность периода адаптации клеток к биоциду ПГМГ зависит от его содержания в среде. При увеличении кон­центрации биоцида ПГМГ наблюда­ется задержка роста численности популяции клеток (лаг-фаза) более чем на двое суток до появле­ния культивируемой формы микроорганизмов. Этот период задержки роста характеризует фи­зиологический уровень адаптации клеток.

Как известно, жизнеспособность микроор­ганизмов при воздействии неблагоприятных факторов среды характеризуется чувствитель­ностью и устойчивостью клеток к этим факто­рам. О чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам можно судить по минимальной концентрации вещества, вызы­вающей задержку роста клеток. Торможение жизненной активности клеток рассматривается как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов.

Полученные на разных стадиях адаптации клетки могут быть использованы для оценки их чув­ствительности и устойчивости к биоцидам.

Существует максимальная концентрация антисептика, выше которой физиологическая адаптация микроорганизмов к нему невозмож­на ввиду превышения адаптационных возмож­ностей клеток. Данная концентрация характе­ризует границу физиологической устойчивости микроорганизмов к биоциду.

Вместе с тем для микроорганизмов возмож­на генетическая адаптация, связанная со слу­чайной комбинацией полезных мутаций, при­водящая к повышению устойчивости к биоци­ду. Этот процесс требует значительно более длительных периодов времени и может растя­гиваться на десятки лет.

Данные методы позволяют установить, что адаптация микроорганиз­мов к биоцидам сопровождается увеличением численности выживших форм клеток, снижением их чувствительности и повышением устойчиво­сти. Чем ниже концентрации септика, тем выше скорость адаптации микроорганизмов к неблагоприятному фактору. Существуют максимальные концентрации антимикробных веществ, выше которых клетки физически не адаптируются. Основными параметрами, характеризующими адаптационные свойства микроорганизмов, являются: скорость адаптации, период времени адаптации, чувствительности микроорганизмов к антисептикам, содержание устойчивых форм клеток.

Использование методов выращивания микроорганизмов в агаре позволяет выделят культивируемые формы клеток и следить за изменением их уровня чувствительности и устойчивости к антимикробным веществам, а также определять содержание устойчивых форм клеток. Однако эти методы длительны, трудоемки и не позволяют анализировать некультивируемые формы клеток, содержание которых может достигать в природных условиях 90% всей численности популяции микроорганизмов.

Это вызывает необходимость разработки более эффективных инструментальных методов анализа адаптационных свойств микроорганизмов и определения содержания некультивируемых форм клеток [20].