5'РДнк → 5'онднк

5'РРнк → 5'онрнк

Применение: 1. Отщепление 5'-фосфатов от ДНК или РНК перед включением 5'-концевого ³²Р.

2. Отщепление 5'-фосфатов от фрагментов ДНК для предотвращения сшивания концов одной молекулы

ТЕРМИНАЛЬНАЯ ТРАНСФЕРАЗА

Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза – катализирует присоединение дезоксинуклеотидов к 3'-ОН концу молекул ДНК.

Кофактор: Mg²⁺

Субстрат: одноцепочечная ДНК с 3'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с выступающим 3'-ОН концом

Кофактор: Со²⁺

Субстрат: двухцепочечная ДНК с тупыми концами или двухцепочечная ДНК с выступающим 5'-р концом

Получение генетического материала

Фрагменты ДНК, предназначенные для клонирования, получают химическим или ферментативным синтезом, гидролизом рестриктазами и другими эндонуклеазами, дроблением гидродинамическим способом или ультразвуком. Изменяя условия, можно получить фрагменты разной длины, но в ряде случаев фрагменты ДНК перед клонированием фракционируют по размеру. Образующиеся двунитевые фрагменты ДНК обладают разными концами, что определяет выбор метода их присоединения к векторным молекулам. Если фрагменты синтезированы или получены воздействием рестриктаз, концы их могут быть тупыми или липкими. Фрагменты, полученные в результате неспецифического дробления ДНК, имеют на концах случайные однонитевые участки. При этом разрывы распределяются по молекулам случайно, так, что среди образовавшихся фрагментов всегда содержится любой из генов в неповрежденном виде. Расщепление ДНК рестриктазами носит неслучайный характер. Если в клонируемом гене имеется сайт узнавания используемой рестриктазы, то ведут ограниченный гидролиз ДНК, чтобы не разрушить этот ген.

1. Выделение природных генов с помощью рестриктаз, которые вызывают гидролиз ДНК с образованием липких концов.

Рестриктазы действуют на ДНК любых организмов, если в ней есть распознаваемые сайты – палиндромные участки. В ГИ используется более 500 рестриктаз, способных разрезать ДНК в 120 местах.

Недостатки: не всегда можно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, в котором содержится нужный ген;

В составе вырезанного фрагмента ДНК могут оказаться интроны и рекДНК не смогут экспрессироваться в прокариотических клетках из-за отсутствия способности к процессингу и сплайсингу.

2. Химико-ферментативных синтез генов

Ему предшествует секвенирование – расшифровка нуклеотидной последовательности. Синтезируют короткие (8-16 пн) одноцепочечные фрагменты ДНК, затем их соединяют с помощью лигаз и отжигают, т.е. дают возможность образоваться двухнитевым молекулам ДНК.

3. Ферментативный синтез генов

Выделяют мРНК и на ней, с помощью ревертазы синтезируют нить ДНК. Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регуляторной части и промотора, т.е. не могут функционировать в клетках. При переносе в бактерию, к структурным генам присоединяют промотор оперона, и ген начинает работать.

Векторные молекулы днк

Вектор – обязательная генетическая конструкция, используемая в опытах по генной инженерии. Вектором (лат. – переносчик, носитель) в ГИ называют молекулу ДНК, способную самостоятельно реплицироваться, включать чужеродную ДНК, переносить ее в реципиентные клетки и стабильно там поддерживать. Векторы используют для создания in vitro молекул рекДНК и для последующего введения их в клетки, в составе которых они клонируют число чужеродных генов.

Требования к вектору.

1. Вектор должен длительное время существовать в популяции клеток- хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток.

2. В любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках. Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие отличить трансформированные клетки: Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений). Это могут быть гены ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д. Основной принцип работы такого маркера – способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде, с добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление нетрансформированных, нормальных клеток. Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано (гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT).

3. Структура вектора должна допускать встраивание в нее чужеродной последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной целостности. Это значит, что вектор должен содержать хотя бы один единичный сайт рестрикции.

Классификация векторов:

По области использования:

1. Клонирующие (клонирование генов, кДНК или любых фрагментов ДНК).

2. Экспрессирующие (синтез мРНК и белков).

3. Интегративные (обеспечивают интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса)

4. Специализированные векторы (секвенирование и мутирование генов).

По происхождению:

1. Плазмидные

2. Фаговые

3. Гибридные (сочетают свойства плазмид и фагов).

По структуре ДНК:

1. Кольцевые

2. Линейные

По способу поддержания в клетке:

1. Автономные (реплицирующиеся самостоятельно)

2. Интегративные (реплицирующие в составе клеточной хромосомы

По числу молекул в клетке:

1. Малокопийные (несколько копий)

2. Мультикопийные (десятки копий).

По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме:

1. Моно-

2. Бирепликонные, их также называют челночными, если они могут реплицироваться в клетках различных видов

Плазмиды - внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, способные к автономной репликации.

Самые распространенные плазмидные векторы клеток E. coli – плазмида pBR322 и ее производные. Буквы B и R указывают на авторов Ф. Боливара и Р. Родригеса. Длина плазмиды 4361 п.н. Этот вектор полностью секвенирован, содержит репликатор от плазмиды pMB1 и сохраняет от нее свойство мультикопийности (15-20 копий на клетку) и способность к амплификации в присутствии хлорамфеникола и левомицетина).

Из двух других плазмид в pBR322 переданы два гена устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрациклину. Гены устойчивости к антибиотикам содержат несколько единственных сайтов рестрикции. В совокупности этот вектор обладает большими возможностями для клонирования генов.

Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке в условиях отсутствия селективного давления, то считается, что они принадлежат к одной группе несовместимости. Несовместимость плазмид обусловливается подавлением репликации одной из них или блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам перед их делением. Оба механизма действуют независимо друг от друга. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке, независимо от числа копий (до 8-10 разных плазмид).

Одни плазмиды несут специфический сайт инициации репликации и могут реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с широким кругом хозяев.

Различают плазмиды со строгим и ослабленным контролем репликации. Минимальный размер плазмид со строгим контролем репликации 20-30 тпн, а максимальный – на порядок больше. Плазмиды с ослабленным контролем репликации обычно невелики – не более 15-30 тпн. Строгость контроля репликации плазмид заключается в наличии у них механизма ограничения числа копий до 1-3 молекул на клетку. При переходе в стационарную фазу роста плазмиды со строгим контролем перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать массы бактериальной ДНК.

Плазмиды со строгим контролем репликации способны к интеграции в бактериальную хромосому. При этом они подчиняются репликационному аппарату бактериальной хромосомы и могут неопределенно долго существовать в ее составе. Такие плазмиды получили название эписом.

Контроль числа копий осуществляет базовый репликон плазмиды (его размер около 2-3 т.п.н.), в который входят сайт начала репликации ori, сайты контроля за копийностью cop (лат) и несовместимостью inc (incompatibility), а также гены, чьи продукты функционируют на этих сайтах.

Фенотипические признаки. Плазмиды передают клеткам различные признаки: устойчивость к антибиотикам (более 20), тяжелым металлам: висмуту, кадмию, кобальту, ртути, свинцу; соединениям мышьяка, УФ-свету и т.д. Плазмиды, которые не выявляются по фенотипическим признакам, называются криптическими.

В природе плазмиды играют роль посредников, способствуя межклеточному обмену генами. Такой обмен приводит к быстрой адаптации клеток к изменяющимся факторам среды. Частота таких явлений в природе низка. Однако в последнее время она возросла, в результате чрезмерного использования в медицине антибактериальных веществ и загрязнения окружающей среды промышленными отходами. В клиниках вместо естественных чувствительных штаммов стали выделять их варианты, устойчивые к лекарственным веществам, а в местах скопления отходов и ядов были выявлены микроорганизмы, активно утилизирующие эти вещества. Плазмиды также могут вызывать изменения в составе белков внешней мебраны, что приводит к их антигенной вариации и способствует повышению устойчивости бактерий против иммунной системы животных.

Плазмида F (или фактор фертильности) представляет собой малокопийную конъюгативную эписому клеток E. coli К12, относящуюся к IncF1-группе несовместимости и обладающую строгим контролем репликации. Размер ее кольцевой ДНК составляет около 100 тпн, у нее идентифицированы около 60 генов. Попадая в клетку, эта плазмида изменяет ее свойства. Клетки приобретают чувствительность к некоторым фагам, а также становятся донорами ДНК и блокируют конъюгационный перенос в них чужой ДНК (явление поверхностного исключения). Эта плазмида может существовать как автономно в цитоплазме у F⁺ донора, так и встраиваться в бактериальную хромосому. Клетка после интеграции в ее хромосому F-плазмиды приобретает способность с высокой частотой ориентированно передавать свои гены в реципиенты. F-плазмиды представляют пример генной инженерии in vivo, осуществляющейся в природе с помощью плазмид.

Фаговые векторы

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 тпн. Для работы с более крупными фрагментами ДНК (5-25 тпн) разработаны векторы на основе бактериофагов. Трансформирующая активность фагов в 1000 раз выше, чем у плазмид. Для клонирования в клетках E. сoli широко используются фаги λ и М13.

После проникновения фага в клетку бактерии развитие фага может идти по двум путям. Если реализируется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизируется) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. Это хорошо видно по осветлению культуральной суспензии. При другом пути (лизогенном) фаг включается в хромосому бактерии как профаг и реплицируется в клетке вместе с бактериальной хромосомой. При неблагоприятных условиях (недостаток питательных веществ и т.д.) интегрированная фаговая ДНК высвобождается и запускается литический цикл развития. В природе основной приток генов в бактерии за счет трансдукции обусловлен лизогенными умеренными фагами.

В середине молекулы ДНК фага λ (длиной около 50 тпн) расположен участок хромосомы (около 15 тпн), который не является необходимым для литического развития бактериофага. Его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осуществить клонирование фрагментов путем размножения рекомбинантного бактериофага.

Чтобы получить лизаты (т.е. суспензии с фагами) бактерии, несущие лизогенные фаги, обрабатывают ультрафиолетом, митомицином С или повышенной температурой. Хранят лизаты фагов над хлороформом, который убивает все неинфицированные и неиндуцируемые клетки донора.

Для упаковки молекул ДНК в фаговую частицу in vitro смешивают в пробирке бесклеточные экстракты двух штаммов E. coli. В одном штамме содержится мутация, приводящая к инактивации одного из белков фагового капсида, а в другом штамме – мутация, препятствующая включению фаговой ДНК в головку бактериофага. Таким образом, хотя экстракт каждого по отдельности штамма содержит пустые головки, фаговую ДНК и отростки, полноценный фаг в этих экстрактах не образуется. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов E. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций и сборке полноценных фаговых частиц. При этом образуется 10⁴ – 10⁵ фаговых частиц на 1 мг упаковываемой ДНК.

Космиды - это небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага λ. Поскольку размеры многих генов животных и растений велики (35-40 тпн), они не могут быть эффективно клонированы с помощью плазмид или фагов (вмещающих 15-25 тпн) при создании геномных библиотек. В этих случаях используются космиды, обладающие большой емкостью.

По существу от фага в космиду вставляется лишь небольшой участок ДНК фага (cos-сайты), а вместо остальной фаговой ДНК вставляется плазмида (например pBR322). Именно за счет этого размер вставляемой чужеродной ДНК увеличивается до 50 тпн. Используя космиду, в присутствии фага-помощника чужеродная ДНК может быть упакована в фаг и после лизиса клеток отобрана в виде фаговых частиц. Однако такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной и не может размножаться как обычный фаг, поскольку у нее нет ДНК, кодирующей белки, необходимые для сборки фага. После адсорбции такой фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 тпн. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селективные маркеры в виде устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания. Таким образом, стадия упаковки ДНК космид в фаг используется лишь для того, чтобы облегчить процесс введения рекомбинантной ДНК большого размера внутрь бактерий. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции.

Фазмиды.- векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, как у фага λ, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий. Эти векторы как и фаговые, используются для клонирования кДНК и геномной ДНК, с эффективностью инфицирования клеток E. coli в 100 раз выше, чем при трансформации плазмидами. Это существенно облегчает конструирование банков генов, содержащих до миллиона независимых клонов.

YAC-вектор

Для исследования генов хромосом растений, животных и человека, когда необходимо клонировать фрагменты ДНК в несколько сотен тысяч пн, используются другие векторные системы, примером которой является YAC-вектор (yeast artificial chromosome). Этот вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей. Вектор содержит в себе:

1. центромеры, теломеры и последовательность, обеспечивающая автономную репликацию);

2. amp^r - для селективной амплификации и маркеры TRP1 и URA3 для идентификации клеток, содержащих вектор;

3. сайты рестрикции (EcoRI и BamHI)

При подготовке к клонированию YAC – вектор, выделенный в виде плазмиды, расщепляют рестриктазой BamHI, чтобы перевести ее в линейную форму. После этого проводят второе расщепление вектора рестриктазой EcoRI c образованием двух его «плечей», содержащих теломеры. Полученные «плечи» лигируют с крупными фрагментами клонируемой ДНК, полученной путем частичного расщепления высокомолекулярной хромосомной ДНК. Полученные рекДНК трансформируют в клетки дрожжей и трансформанты отбирают на селективной твердой среде. В таком векторе удается осуществить клонирование фрагментов ДНК до 700 тпн. YAC – вектор имеет ряд недостатков, которые частично устранены в векторе BAC (искусственная хромосома бактерий – bacterial artifical chromosome), основу которой составляет плазмида F (половой фактор E. coli). Такой вектор вводят в дрожжи путем электропорации, что повышает эффективность образования трансформантов в 10-100 раз.

Транспозоны

Транспозоны - сегменты ДНК, которые контролируют собственную транспозицию (перемещение) из одного сайта ДНК в другой путем вырезания из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы или плазмиды. Впервые были открыты в 40-х годах американской ученой Барбарой Мак-Клинток у кукурузы.

Механизм перемещения фрагментов ДНК по геному до конца не выяснен. ДНК переносится ферментом транспозазой. Фермент кодируется последовательностью нуклеотидов в середине транспозона. Он специфически взаимодействует с концевыми инвертированными повторами мобильного элемента и может вырезать его из хромосомы. Вырезание может происходить точно – с восстановлением исходной структуры участка ДНК, и неточно, то есть с делециями и вставками от одного до нескольких нуклеотидов. Это приводит к появлению стабильных мутаций и является одним из механизмов создания новых последовательностей ДНК. Длина их от 2 до 10 тысяч нуклеотидных пар. У высших эукариот на долю транспозонов приходится примерно 10% ДНК клетки.

Выделяют:

- Ретротранспозоны, которые перемещаются по геному путем обратной транскрипции с их РНК

- ДНК-транспозоны, перемещающиеся путем прямого вырезания и вставки с использованием кодируемого транспозонами фермента транспозазы

Перемещение транспозонов способно вызвать дестабилизацию генома, в частности, не менее 80% мутаций и перестроек ДНК яаляются следствием их активности.

Биологический смысл перемещения отдельных сегментов ДНК: прерывание соответствующего гена, что ведет к эволюции; регуляция деятельности генов, так как транспозоны могут нести сигналы для начала считывания генов. В новых областях усиливают или запрещают работу гена. Транспозоны также участвуют в горизонтальном переносе генов.

Поскольку подвижные гены могут перемещаться в пределах генома с одного места на другое, то они могут быть эффективными векторами для передачи рекомбинантной ДНК. Генетическая трансформация с помощью векторов на основе транспозонов была впервые осуществлена на дрозофиле. С помощью транспозируемого элемента Р дрозофиле был передан ген, обуславливающий коричневую окраску глаз.

Преимущества:

перенос генов происходит с высокой частотой

не влечет значительных перестроек интегрируемой ДНК.

можно переносить достаточно большие фрагменты ДНК.