Методы генной инженерии

Генетическая инженерия – это методы получения рекомбинантных (гибридных) ДНК из фрагментов геномов различных организмов, введение их в клетку и обеспечение условий для экспрессии чужеродных генов. ГИ является разделом экспериментальной молекулярной биологии, лежащим в основе современной биотехнологии.

ГИ это манипуляция с генами in vitro с целью получения новых рекомбинантных организмов и изучения структуры генов. (Матвиенко Н.И. 2001). Из последнего определения понятно, почему ГИ еще называют технологией рекомбинантных ДНК.

Цели ГИ: 1) борьба с болезнями (генотерапия; синтез лекарственных препаратов с использованием живых организмов в качестве биореакторов)

2) производство продовольствия

Задачи ГИ: 1) Создание рекомбинантных ДНК, пригодных для переноса в другие клетки

2) Разработка методов введения рекомбинантной ДНК в клетку

3) Создание условий для нормальной экспрессии генов, введенных в клетку.

Главный объект: ДНК

Дата рождения: 1972г. – группа П. Берга в США создали первую рекДНК, объединившую генетический материал из трех источников:

-полный геном онкогенного вируса обезьян SV40

-часть генома умеренного бактериофага λ

-гены лактозного оперона E. Coli

Основные достижения, которые обусловили рождение ГИ:

- 1928 г., открытие Гриффитом трансформации пневмококков;

- 1940-1944 гг. Эвери, МакЛеод, Маккарти обнаружили, что ДНК, а не белок

определяют наследственные свойства организмов;

- 1953 г. Уотсон и Крик предложили двухспиральную модель ДНК, которая объясняла не только структуру самой ДНК, но и каким образом происходит удвоение (репликация) ДНК, один из самых важных для живых организмов процесс – процесс передачи генетической информации;

- 1958 г. возникновение генетической энзимологии. А. Корнберг обнаружил фермент, осуществляющий репликацию ДНК, т.н. ДНК-полимеразу 1 (фермент Корнберга), за что был награжден Нобелевской премией.

1961-1966 гг. расшифрован генетический код и выяснено строение элементов, управляющих действием генов и синтезом белков: промоторов, операторов и т.д.);

- В начале 60-х годов Вернером Арбером было сделано ключевое для ГИ открытие таких ферментов, как рестрикционные эндонуклеазы, которые могли разрезать ДНК в строго определенных местах, что открыло путь к получению рекомбинантных ДНК;

- В это же время в лаборатории Кораны был синтезирован химико- ферментативным путем один из генов кишечной палочки (ген аланиновой тРНК). Интересна реакция на это выдающееся событие некоторых ученых того времени. Один из них сказал: «Подобно проекту «Аполлон» (полет на Луну), все это сделано лишь для того, чтобы показать, что это можно сделать, и как и этот проект, никогда не будет повторено». Однако более дальновидным оказался нобелевский лауреат, биохимик Артур Корнберг. «То что вы сделали - сказал он Коране – это атомная бомба 1980 г.»

- 1970 г. Открыт фермент обратная транскриптаза (синоним - ревертаза),

который катализирует синтез ДНК, используя в качестве матрицы РНК. До этого полагали, что процесс может идти только в одном направлении ДНК – РНК – белок (т.н. центральная догма молекулярной биологии). Для ГИ это имело важное значение, поскольку матричная РНК содержит информацию, достаточную для синтеза одного или нескольких белков, т.е. эквивалентную одному или нескольким генам. Кроме того, в клетке может быть много копий мРНК одного типа и всего лишь одна молекула ДНК. Используя ревертазу и выделенную РНК можно синтезировать ДНК, содержащую всего один или несколько генов. В 1975 г. используя указанный выше подход, с помощью обратной транкриптазы был синтезирован ген глобина;

1972-73 гг. считают рубежом создания генетической инженерии, когда в лаборатории Берга была получена in vitro и введена в бактерию E. coli первая рекомбинантная молекула ДНК

В дальнейшем лавинообразное накопление новых знаний и методов привело к тому, что ГИ превратилась из искусства в ремесло. Наиболее значительные успехи связаны с применением эндонуклеаз рестрикции, молекулярного клонирования, секвенирования нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции.

Развитие ГИ привело к тому, что сейчас возможны манипуляции с геномом любого организма от бактерий до млекопитающих, чтобы осуществить синтез биологических продуктов, которые в норме синтезируются другими организмами. Эта технология не только облегчает продукцию некоторых белков в недоступном ранее количестве, но и открывает возможности для создания совершенно новых, высоко модифицированных биоактивных продуктов. Эта технология используется в широком круге различных производств, в фармацевтической и пищевой промышленности, косметике, охране окружающей среды и т.д.

Современная стратегия ГИ:

1. Получение нужного гена (трансгена), намеченного для переноса

2. Создание генетических конструкций – векторов (переносчиков), в составе которых гены (трансгены) будут внедряться в геном другого вида

3. Конструирование рекДНК

4. Генетическая трансформация – перенос и включение рекДНК в клетки-мишени хозяина

5. Молекулярная селекция – отбор клонов, несущих рекДНК, осуществляемый с использованием маркерных генов, которые находятся в молекуле рекДНК наряду с трансгеном.

6. Выращивание измененных клеток