Экспрессия генов в трансгенных животных

В 1982 г. проведено первое исследование, в котором генно-инженерным способом удалось, кроме изменения генотипа, изменить и фенотип трансгенных животных. Был создан эффективно экспрессируемый in vivo ген гормона роста и введен в геном мыши. Этот ген включал в себя:

1) промоторно-регуляторную область гена металлотионеина 1 мыши

2) структурную часть хромосомного гена гормона роста крысы

Экспрессия гена МТ-1 контролируется на транскрипционном уровне ионами тяжелых металлов и глюкокортикоидными гормонами. Поэтому, для достижения высокой продукции гормона роста в корм мышам добавляли ZnSO₄. В результате уровень гормона роста в крови некоторых животных в 100-800 раз превысил норму, и трансгенные мыши достигли гораздо больших размеров.

В 1998г. созданы мыши, несущие два трансгена под контролем промотора тканеспецифичного гена β-лактоглобулина. Трансген представлял собой последовательности кДНК тяжелой и легкой цепей IgA, нейтрализующего гастроэнтеритный коронавирус. В результате у всех потомков во время лактации в молоко секретировались антитела, эффективно нейтрализующие вирус (до 6мг антител в 1мл молока).

Применение:

1. создание животных-продуцентов специфических веществ в молоке

2. для получения трансгенных животных, обеспечивающих лактогенный иммунитет потомства против инфекционных заболеваний

Установлено, что около половины всех линий трансгенных животных не способны экспрессировать трансген. Это может быть связано с:

1. присутствием в трансгене ингибиторных последовательностей (например, последовательностей эукариотического происхождения)

2. особенностями конкретного сайта интеграции трансгена (экзогенная ДНК может встроиться в транскрипционно неактивную область)

Применение трансгенных животных в фундаментальныхисследованиях

1. анализ временной и физиологической регуляции экспрессии генов

2. анализ последствий различных отклонений в экспрессии генов на уровне целого организма (в том числе и онкогенов)

3. получение случайных новых мутантов, возникших в результате внедрения трансгена в тот или иной функциональный ген

4. получение мутантов с направленно инактивированными генами – так называемых нокаутных животных (knock out – выбить)

Нокаутные животные

Это животные, гомозиготные по направленно инактивированному гену.

Использование: для изучения детерминируемых данным геном свойств на уровне организма.

Схема получения:

1. Фрагмент целевого гена, который планируют инактивировать in vivo, извлекают из геномной библиотеки на основе фага λ или космид

2. Внутрь фрагмента встраивают доминантный селективный маркер, одновременно с этим часть целевого гена делетируется. Такую конструкцию называют нацеленным вектором – это гибридная плазмида, в которой к селективному маркеру справа и слева присоединены сегменты целевого гена, называемые фланкирующими последовательностями

3. Нацеленный вектор расщепляется рестриктазой вне фрагмента встройки для перевода его в линейную форму

4. Линейные ДНК вводят (чаще всего электропорацией) в культуру эмбриональных стволовых клеток

5. На селективной среде отбирают клетки трансформантов. Отбираемые клоны гетерозиготны по мутантному гену, так как встройка происходит в одну из гомологичных хромовом

6. Родившихся химерных мышей скрещивают с мышами исходной линии и получают гетерозиготное потомство по мутантному гену

7. Гетерозигот скрещивают между собой и отбирают в потомстве гомозиготных по мутантному гену мышей

Нокаутных животных также используют для создания линий, более чувствительных к тому или иному инфекционному агенту, чем исходные животные. Например, трансгенные животные, дефектные по гену интерлейкина 12 являются моделью колонизации слизистой желуда бактериями Helicobacter pilori, способствующими развитию язвенной болезни желудка у человека.

Недостаток: инактивация ряда генов приводит к летальному исходу.

Биотехнологическое применениетрансгенных животных

1. Продукция целевых белков в молочной железе с секрецией в молоко. Коза в период лактации производит до 800л молока в год и при содержании в нем рекомбинантного белка около 5г̸л вырабатывает до 4кг белка в год. В 1988г получены трансгенные овцы, продуцирующие с молоком факторы свертываемости крови. В настоящее время создано около 20 типов трансгенных коров, коз, свиней, овец и кроликов, вырабатывающих моноклональные антитела, эритропоэтин, интерлейкины, антитрипсин, тканевый активатор плазминогена.

2. Создание высокопродуктивных животных с более интенсивным ростом (трансгенный лосось).

Трудности создания трансгенных животных

1. Традиционные технологии создания трансгенных животных путем микроинъекции в пронуклеус очень трудоемки и малоэффективны. Полного развития достигает менее 1% трансдуцированных зигот.

2. Трансгенные особи часто оказываются нежизнеспособными или с нарушенными репродуктивными функциями.

Пример: получены овцы, трансгенные по гену химозина с промотором β-казеина. Химозин – ключевой фермент сыроделия. Обычно его выделяют из слизистой оболочки сычуга забитых молочных телят и ягнят (устаревшая и малоэффективная технология).

Однако молочная продуктивность трансгенных животных была в 8-10 раз ниже, чем у обычных особей, по причине закупоркизначительного числа альвеол и молочных протоков в результате свертывания молока.

Химозин образуется в клетках в виде неактивного предшественника – прохимозина. Прохимозин переходит в химозин при снижении рН до 4-4,5. Однако в молочной железе трансгенных животных таких условий не было. Процесс образования молока начинается в последней трети беременности, следовательно, молоко с прохимозином длительное время находится в альвеолах и молочных протоках. При повышении температуры молочной железы незначительная часть прохимозина трансформируется в химозин, вызывая свертывание молока.