Трансгенные животные

Это линии животных, передающие по наследству приобретенные трансгены. Впервые были получены в 1974 (ДНК вируса SV40 введена в эмбрионы мыши).

Получение трансгенных животных:

1. Использование ТСС-клеток (клетки тератокарциномы мыши)

ТСС-клетки способны размножаться в культуре, терять свои неопластические свойства и нормально дифференцироваться после инъекции в эмбрионы мыши, находящиеся на стадии бластоцисты. Полученные таким образом животные мозаичны, то есть их соматические и половые клетки являются смесью ТСС-клеток и клеток с генотипом исходного эмбриона.

Показана возможность интеграции в геном стволовых ТСС-клеток гена тимидинкиназы вируса простого герпеса и гена β-глобина человека.

Применение: анализ in vivoрегуляции экспрессии различных генов в процессе эмбрионального развития организма.

2. Микроинъекция ооцитов (1982)

Наиболее популярен, хотя требует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования.

Достоинства: быстрота и надежность

Этапы метода:

1. Донорных мышей самок скрещивают с самцами-производителями

2. Через 12 часов выделяют оплодотворенные яйцеклетки и помещают их в культуру

3. В один из пронуклеусов инъецируют очищенную клонированную ДНК

4. Ооциты, пережившие инъекцию, возвращают в естественную среду

5. Трансгенных животных идентифицируют, используя специфичную ПЦР и гибридизационный анализ

6. Первичных трансгенных животных скрещивают для получения трансгенных линий. Всех детенышей анализируют до получения гомозиготных линий

Недостаток: от 5 до 15% трансгенных вставок в гомозиготном состоянии летальны, то есть не всегда удается получить гомозиготные линии.

Точный механизм, обеспечивающий интеграцию рекДНК в хромосомы клетки-хозяина, неизвестен. Установлено, что в 70% случаев интеграция ДНК происходит до первого цикла репликации ДНК. Остальные 30% животных обнаруживают ту или иную степень мозаичности. Обычно имеется только один участок интеграции трансгена, в то же время количество его копий в геноме сильно варьирует и может достигать нескольких тысяч. Участок интеграции случаен.

3. Эмбриональные стволовые клетки (ЕS-клетки)

ЕS-клетки – это клетки, полученные из бластоцисты, которые можно культивировать in vitro и после необходимых манипуляций вернуть в организм, инъецируя в бластоцисту.

Трансгены вводят в бластоцисту либо путем трансфекции, либо инфицируя их рекомбинантными ретровирусами.

Преимущества: возможно проводить селекцию трансформированных клеток по определенным параметрам (число копий трансгена, его локализация, характер экспрессии)

Все полученные таким образом организмы мозаичны, то есть состоят из содержащих и не содержащих трансген клеток. Для преодоления этой проблемы трансформированные ЕS-клетки используют в качестве доноров ядер, которые способны колонизировать энуклеированные ооциты.

4. Ретровирусы

Достоинства: не требует дорогостоящего оборудования, несложная процедура.

Недостаток: часто формируется организм, мозаичный по числу и локализации вирусных встроек в клетки

Этапы метода:

1. Эмбрионы на стадии морулы (восьмиклеточный организм) освобождают от яйцевой оболочки и помещают в среду с фибробластами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус

2. Инфицированные эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, вводят самке