Секвенирование днк. Этапы секвенирования днк.

Секвенирование - представляет собой определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК путем получения серии комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. Является последним этапом молекулярного анализа предварительно отобранного, клонированного и протестированного более простыми методами фрагмента ДНК.

Существует два основных метода секвенирования; метод Максама-Гилберта (основан на химическом расщеплении ДНК по одному основанию) и метод Сэнгера (дидезокси-метод). Метод Сэнгера более надежен и прост в исполнении, и на практике его используют чаше.

Метод Сэнгера или дидезоксисеквенирование основан на синтезе изучаемой цепи ДНК in vitro с остановкой синтеза на заданном основании путем присоединения дидезоксинуклеотида. Дидезоксинуклеотид лишен гидроксильных групп при атомах сахарного кольца не только в 2'-, но и в 3'-положении, что делает его неспособным формировать фосфодиэфирную связь со следующим нуклеотидом.

Для проведения секвенирования необходимы:

1) секвенирующий праймер (искусственно синтезированная олигонуклеотидная последовательность, комплементарная определенному участку исходной молекулы ДНК),

2) набором из четырех дезоксинуклеотидов dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых изотопно меченный

3) один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP)

4) ДНК-полимераза.

Сам метод включает следующие этапы:

1) гибридизация изучаемого фрагмента ДНК с праймером

2) ферментативный синтез ДНК

3) денатурация полученных продуктов формамидом (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер)

4) электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов) и

5) анализ результатов на радиоавтографе. На большинстве радиоавтографов можно четко различить 250—350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250-350 п.н. Нуклеотидная последовательность на радиоавтографе считывается снизу вверх.

Таким образом, по размеру синтезированных фрагментов может быть определена локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК.

Для прочитывания более длинных последовательностей существует ряд методов, представляющих собой разные модификации метода Сэнгера. Эти методы основаны на предварительном клонировании ДНК в векторах, сконструированных на основе фага М13 E.coli для получения протяженных одноцепочечных участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвенированы без денатурации и праймирования. Особенность фага М13 E.coli состоит в возможности его существования в двух формах: двухцепочечной репликативной, функционирующей как плазмида, и одноцепочечной фаговой, использующейся в качестве матрицы для секвенирования. Выделив после клонирования одноцепочечные фаговые ДНК со вставкой (размер около 500 п.н.), праймер гибридизуют с последовательностью вблизи вставки, и проводят дидезоксисеквенирование.

Для секвенирования крупных фрагментов ДНК (около 2000 п,н.) используют более сложные (комбинированные) подходы. Один из них заключается в предварительном клонировании данного фрагмента в плазмидном векторе и построении его подробной рестрикционной карты, идентификации перекрывающихся рестрикционных фрагментов длиной 100-500 п.н. Далее, субклонировав каждый из этих фрагментов в ДНК M13 E.coli, их секвенируют и определяют последовательность исходного участка ДНК. Так как субклонированные фрагменты могут быть встроены в противоположных направлениях, то праймер в одном случае будет инициировать синтез первой цепи, а в другом - комплементарной ей, а значит возможно одновременное секвенирование обеих цепей.

Для секвенирования фрагментов ДНК более 5000 п.н. используют методы секвенирования двухцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Один из них носит название «праймер-опосредованной прогулки» («блуждающей затравки»). Суть метода заключается в последовательном дидезоксисеквенировании по 250-350 п.н. Этапы метода представляют собой цепочку циклов, включающих синтез праймера, дидезоксисеквенирование и идентификацию нуклеотидной последовательности:

1) отжиг плазмидной ДНК, содержащей вставку, с праймером, комплементарным последовательности одной из цепей векторной ДНК;

2) дидезоксисеквенирование и идентификация первых 250-350 п.н. вставки;

3) синтез второго праймера, комплементарного сегменту вставки, который отстоит от места связывания первого праймера примерно на 300 п.н., и секвенирование следующих 250-350 п.н., и так далее, пока не секвенируют весь фрагмент.

Обязательное условие при секвенировании очень длинных фрагментов иметь праймер длиной не менее 24 нуклеотидов. Это необходимо для того, чтобы избежать спаривания праймера внутри вставки более одного раза.

В настоящее время широкое распространение получила методология автоматического ДНК-секвенирования с использованием меченных различными флуорохромами дидезоксинуклеотидов - электрофорез в этом случае проводят на одной дорожке и на электрофореграмме каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы, которую сканируют в луче лазера, занося данные в компьютер, который сопоставляет их и идентифицирует, выводя на экран нуклеотидную последовательность.. Этот метод широко применялся в ходе реализации программы «Геном человека». Использование автоматических секвенаторов снизило стоимость секвенирования одного звена с 1 $ до 0,1 $.

Однако существуют еще более быстрые методы автоматического секвенирования. Один из них - секвенирование путем гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов (олигонуклеотидной матрицей), включающим все возможные варианты перестановок из 4 стандартных нуклеотидов (А, G, С, Т) определенной длины. Наиболее удобными считаются наборы матриц (чипы) из октануклеотидов., при этом количество возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвенируемый фрагмент ДНК, меченный радиоактивным фосфором, гибридизуется только с комплементарными его участкам октануклеотидами.

В результате определяется спектр октануклеотидов, составляющих исследуемый фрагмент ДНК. Локализация октамеров в изучаемом фрагменте ДНК устанавливается при помощи специальной компьютерной программы.

Метод Максама-Гилберта

Используется для секвенирования одно- и двухцепочечных фрагментов ДНК.

Этапы метода:

1. специфическая химическая фрагментация изучаемого полинуклеотида

2. фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом ³²Р по 5'- или 3'-концу. У двухцепочечной ДНК метятся обе цепи

3. Подготовка меченных фрагментов к секвенированию. Для этого используются клонирующие векторы, содержащие синтетические полилинкеры. После гидролиза рестриктазами, образующими липкие концы, с помощью фрагмента Кленова избирательно метят клонированные фрагменты по одному концу.

4. Меченные фрагменты делят на порции и каждую подвергают определенной химической модификации. Еее проводят так, чтобы на одну молекулу ДНК в среднем приходилось по одной метке.

Пуриновые основания: диметилсульфат – метилирование аденина по положению N³, гуанина – N⁷. Обработка 0,1М HCl при температуре 0ºС приводит к отщеплению метиладенина. Инкубация при 90ºС в щелочной среде (0,1М NaOH) вызывает разрыв цепи ДНК в местах отщепления оснований. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК по остаткам метилгуанина.

Пиримидиновые основания: гидразин. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются тимин и цитозин, а в присутствии 2М NaCl – только цитозин. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК пр точкам модификации

5. После параллельного проведения четырех различных обработок фрагмента ДНК полученные субфрагменты разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле на соседних дорожках

6. С помощью радиоавтографии геля на рентгеновской пленке считывается нуклеотидная последовательность ДНК

Экспрессия в клетках бактерий рекомбинантных ДНК

Одна из важнейших задач генной инженерии – создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных, которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов. Любой полноценный ген состоит из двух основных частей – регуляторной и структурной. Регуляторная часть распознается соответствующими ферментными системами организма и обеспечивает упорядоченную экспрессию его структурной части. Она высокоспецифична в отношении своих природных эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, факторов сплайсинга и т.д.). Чаще всего регуляторная часть не может функционировать в другом генетическом окружении.

Генетическая информация передается по схеме ДНК → (транскрипция) РНК → (трансляция) белок. Это необходимые этапы для экспрессии рекДНК.

Экспрессия эукариотических генов в бактериальной клетке является фундаментальным вопросом биологии. Так как генетический код универсален, то возможность такой экспрессии определяется:

1. наличием в изучаемом гене сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции

2) правильное узнавание их прокариотической клеткой

Основные отличия систем экспрессии про- и эукариот:

1. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК–предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности – интроны, и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Эукариотические гены, имеющие непрерывную кодирующую последовательность, иногда способны правильно экспрессироваться в клетках бактерий.

2. У прокариот существует одна РНК-полимераза, синтезирующая все типы РНК. У эукариот существуют три типа РНК-полимераз:

РНК-полимераза I (синтезирует рибосомные РНК)

РНК-полимераза II (матричные РНК)

РНК-полимераза III (транспортные РНК)

3. Различия по использованию кодонов, терминирующих трансляцию: в эукариотических мРНК используются все три терминирующих кодона, а в прокариотических – только один.

4) Различия в последовательностях мРНК, необходимых для инициации трансляции

5) Различные последовательности, ответственные за связывание транскриптов с рибосомальными РНК

Автономная экспрессия клонированного гена возможна только в случае, если инициация и терминация транскрипции происходит полностью на клонируемом фрагменте. В таком случае экспрессия гена не зависит от типа вектора и ориентации в нем встроенного фрагмента ДНК.

При инициации транскрипции на промоторе вектора синтез полноценного белка, детерминируемого клонированной последовательностью, возможен только при наличии в транскрипте участка связывания бактериальной рибосомы.

Установление экспрессии эукариотических генов в E. coli

1) функциональная комплементация (штамм E. coli, ауксотрофный по гистидину)

2) селективные питательные среды: бактерии не способны расти на питательной среде, содержащей крахмал к качестве единственного источника углерода. В плазмиду рВR322 встроили фрагменты хромосомной ДНК дрозофилы и осуществили трансформацию клеток E. coli гибридными ДНК. Среди трансформантов выявлены клоны, растущие на крахмале. Синтезируемая в E. coli α-амилаза соответствует по своим свойствам данному ферменту дрозофилы.

Клонирование мозаичных генов высших эукариот в клетках E. coli

1. С помощью обратной транскриптазы на молекулах мРНК синтезируется кДНК

2. Достраиваются вторые цепи на кДНК, в результате чего образуются двухцепочечные ДНК-копии мРНК

3. Фрагменты ДНК встраиваются в подходящий клонирующий вектор коннекторным методом или с помощью синтетических линкеров

4. рекДНК вводится в E. coli

К генам, способным эффективно экспрессироваться в эукариотических клетках, относят гибридные гены. Это гены, у которых кодирующая последовательность представлена эукариотической кДНК, а сигналы инициации транскрипции и трансляции имеют бактериальное происхождение.

Пример:

1) Экспрессирующий вектор + фрагмент гена lacZ, содержащий промотор, участок связывания рибосом и триплеты нескольких первых аминокислот β-галактозидазы E. coli, которые задают рамку трансляции клонированной последовательности. При совпадении рамок трансляции β-галактозидазы и клонированной ДНК в бактериальных клетках синтезируется эукариотический белок, содержащий на N-конце дополнительно несколько аминокислот β-галактозидазы. Продукт экспрессии рекДНК представляет собой химерный белок.

2) Плазмида pBR322, в которую по PstI участку встроили кДНК проинсулина крысы в составе гена β-лактамазы. При совпадении рамок трансляции E. coli синтезирует химерный белок, содержащий антигенные детерминанты как инсулина, так и β-лактамазы.

Целевой белок из состава химерного можно извлечь с помощью соответствующих протеаз.

Экспрессия ген-эквивалентов эукариотических полипептидов в клетках E. Coli

Ген-эквивалент – это последовательность ДНК, кодирующая зрелую форму полипептида.

Часть активных полипептидов, таких как нейропептиды или гормоны, обычно синтезируются в виде предшественников, имеющих большую молекулярную массу. В результате специфического процессинга образуется зрелый полипептид и низкомолекулярный пептид. В бактериальной клетке для большинства полипептидов правильный процессинг из пре-белка невозможен. В этих случаях в бактериальной клетке необходимо клонировать последовательность ДНК, кодирующую уже зрелую форму полипептида.

Пример

Ген-эквивалент соматостатина человека синтезируют химическим методом и встраивают в векторные плазмиды, содержащие фрагменты lac-оперона E. coli. Если синтетический фрагмент встраивали по сайту EcoRI в конце гена β-галактозидазы, синтезировался химерный белок, содержащий последовательности как большей части β-галактозидазы, так и соматостатина. Соматостатин высвобождают из химерного белка, обрабатывая его бромистым цианом.

Таким образом, суть разработанного метода заключается в следующем:

1. искусственный ген встраивается внутрь структурного гена, кодирующего определенный бактериальный белок

2. Инициация синтеза РНК и белка происходят на регуляторных участках бактериального оперона, а терминация трансляции – на нонсенс-кодонах синтетического гена

3. Экспрессия гибридного гена приводит к появлению химерного белка, содержащего аминокислотную последовательность бактериального белка и пептида, кодируемого синтетическим фрагментом ДНК

4. Целевой пептид выщепляется из состава химерного белка специфическим химическим или ферментативным гидролизом.

Этот подход использовался для микробиологического синтеза инсулина человека.

Инсулин в клетках человека синтезируется в виде препроинсулина. Это препгормон, который синтезируется на мембраносвязанных рибосомах и содержит сигнальный пептид, обуславливающий секрецию белка из клетки. В процессе секреции сигнальный пептид отщепляется от молекулы. Образующийся в результате проинсулин представляет собой сложную трехмерную структуру с тремя дисульфидными мостиками. Из середины проинсулина выщепляется 35 аминокислот (С-цепь), образуя А- и В-цепи, связанные дисульфидными мостиками, обеспечивающими стабильность четвертичной структуры зрелого белка.

Этапы микробиологического синтеза инсулина:

1. химическим путем синтезируются гены А и В-цепи инсулина

2. Синтезированные фрагменты встраиваются в структурную часть гена антранилсинтетазы в составе векторной плазмиды в правильной рамке трансляции

3. Из образовавшихся химерных полипептидов бромистым цианом выщепляется последовательность А и В-цепей

4. А и В-цепи смешиваются и химически генерируются дисульфидные связи

Таким же способом в 1981 г. был синтезирован лейкоцитарный интерферон человека, а в 1983 г. – иммунный интерферон.

Регуляция транскрипции рекДНК в клетках E. coli

У бактерий транскрипция большинства генов регулируется с помощью системы белков-репрессоров и активаторов, которые влияют на взаимодействие РНК-полимеразы с транкрибируемыми генами. В генной инженерии экспрессия клонированных генов также должна регулироваться, поскольку при избыточной экспрессии продукты экспрессии могут оказывать токсическое действие на бактерии. Для этого конструируют системы, в которых экспрессия клонируемых генов подавлена (репрессирована) на ранних фазах роста культур и дерепрессирована в нужный момент времени.

Рассмотрим две такие системы. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют систему регуляторных элементов лактозного оперона, в другом – систему промотор-репрессор-оператор фага λ.

В векторы вводятся регуляторные последовательности фага λ и lac-оперона, за которыми следуют полилинкеры с несколькими уникальными сайтами рестрикции. В тот же вектор вводится ген-регулятор, кодирующий белок-репрессор. В отсутствие индуцирующего воздействия репрессор связывается с оператором, препятствуя взаимодействию РНК-полимеразы с промотором, под контролем которого находится клонированный ген. Это приводит к резкому снижению уровня транскрипции этого гена и, соответственно низкому содержанию белкового продукта. Для индукции экспрессии в случае с lac-опероном используют синтетический аналог природного индуктора (алло-лактозы) – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид. Индуктор связывается с молекулой репрессора и нарушает его взаимодействие с оператором. lac-промотор становится доступным для РНК-полимеразы, которая начинает транскрибировать гены, расположенные за промотором.

В системе репрессии –дерепрессии фага λ используют ген репрессора, содержащий температурочувствительную мутацию. Мутантный белок –репрессор сохраняет способность подавлять синтез РНК только при температуре (28-30ºС). При повышении температуры до 42ºС происходят инактивация белка-репрессора и репрессия генов, расположенных под контролем соответствующих промоторов.

Для обеспечения регулируемой тканеспецифической экспрессии рекДНК в соматических клетках животных и растений в составе векторов используют энхансеры, которые избирательно стимулируют транскрипцию в соответствующих тканях, клетки которых не экспрессируют необходимые регуляторные белки.