Области применения и примеры использования пцр

1. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования.

2. Клонирование заданных фрагментов ДНК, т.е. извлечение из состава молекул ДНК известных нуклеотидных последовательностей с целью встройки их в молекулярные векторы

3. Создание олигонуклеотидных микрочипов

Олигонуклеотидная микроматрица – система олигонуклеотидов известной последовательности, иммобилизованных на твердом носителе в строго определенном порядке.

Цель – секвенирование коротких фрагментов ДНК путем гибридизации.

В качестве твердого носителя используют стекло, нейлоновые мембраны, силиконовые поверхности.

Препараты ДНК, предназначннные для гибридизации на микрочипе, флуоресцентно метят. После гибридизации и отмывки микрочип анализируют с помощью лазерного сканера. Аналогично создается матрица на основе мРНК, служащая для изучения экспрессии генов.

4) Диагностические технологии на базе пцр

В зависимости от природы праймера (специфичный, полуспецифичный, произвольный) и способа идентификации продуктов амплификации различают несколько методов и маркеров ПЦР-анализа.

Наиболее широко используются молекулярные маркеры, которые применяют для определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации, картирования генома животных, человека, растений и микроорганизмов.

К числу таких маркеров относятся RAPD-маркеры и микросателлиты.

Микросателлиты (или простые короткие повторы) — варьирующие участки ДНК, состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований^[1].. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями.

RAPD-маркеры – random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR –случайно амплифицированная полиморфная ДНК).

Использование RAPD-маркеров позволяет амплифицировать ДНК из любого участка генома, в том числе фрагменты ДНК с неизвестной нуклеотидной последовательностью.

Используют стандартные наборы праймеров – случайные (произвольные) праймеры. Использование олигонуклеотидных праймеров произвольной структуры основано на том, что в больших геномах для них имеются множественные сайты посадки, а следовательно, и инициации ПЦР.

В этом случае используется, как правило, только один праймер и амплифицируются участки между этим праймером и его обратной (инвертированной) последовательностью. Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках – инвертированных повторах (ип). Т.е., продукты RAPD-ПЦР представляют собой анонимную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами разной длины. Их выявляют гель-электрофорезом (как присутствие или отсутствие отдельной RAPD-полосы) RAPD-маркеры являются высокоинформативной характеристикой для оценки генетического разнообразия и родства.

5) Поиск гомологичных генов

Гомологичные гены – это гены, кодирующие ферменты различного строения, но со сходными функциями.

Во всех живых организмах протекают сходные биохимические процессы, катализируемые ферментами, которые ускоряют идентичные химические реакции. Например, как у растений, так и у животных функционирует цикл трикарбоновых кислот, реакции которого катализируют ферменты. Структура этих ферментов у разных организмов может различаться, однако выполняемые ими функции сходны. Такие ферменты, играющие одинаковую роль в метаболизме разных организмов, называют гомологичными.

Несмотря на то, что структура гомологичных белков может варьироваться, они имеют высококонсервативные участки, входящие в состав каталитических центров. По аналогии с белками существуют консервативные

последовательности и в генах.

Если создать праймеры, комплементарные таким консервативным последовательностям, то с помощью ПЦР можно найти гомологичный ген в организме, в котором наличие этого гена неизвестно.

В случае если гомологичный ген в исследуемом организме действительно существует, происходит отжиг праймеров на молекуле ДНК организма. Затем этот участок ДНК, ограниченный праймерами, амплифицируется. Так, выделив какой-то ген, скажем, из мыши, можно узнать, есть ли подобный ген, а, следовательно, фермент и биохимическая реакция у человека.

6) Идентификация маркерных генов

Каждый организм имеет уникальные, свойственные только ему гены или другие участки ДНК. Такие последовательности являются маркерными для организма. Если определить наличие маркерного участка, то можно однозначно диагностировать организм. ПЦР позволяет идентифицировать такие маркерные участки генома. В основе лежит все тот же принцип комплементарности праймеров маркерным фрагментам. Если ПЦР имеет положительный результат, значит, маркеры идентифицированы. Следовательно, определен и вид организма. Этот факт имеет огромное значение в медицинской диагностике.

7) Применение ПЦР в медицинской диагностике

Полимеразная цепная реакция позволяет оперативно поставить диагноз многих заболеваний.

1) диагностика инфекционных заболеваний;

2) диагностика онкологических заболеваний:

– диагностика лейкемий и лимфом;

– диагностика рака груди;

3) диагностика генетических заболеваний;

4) идентификация личности:

– судебная медицина, криминалистика;

– трансплантация органов и тканей;

– определение отцовства;

5) диагностика патогенов в пище.

Главным направлением развития рынка ДНК-диагностики является диагностика инфекционных заболеваний. Если человек страдает заболеванием бактериального или вирусного происхождения, то в его крови обязательно находятся возбудители – бактериальные или вирусные частицы.

Любой возбудитель несет маркерные последовательности ДНК, для которых можно сконструировать праймеры. Таким образом, с помощью ПЦР

можно определить присутствие того или иного микроорганизма в крови, т.е.

поставить диагноз.

В отличие от иммуноферментного анализа, который широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, ДНК-диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания, причем в очень низкой концентрации.

Вот лишь некоторые инфекционные заболевания, которые в настоящее время диагностируются с помощью полимеразной цепной реакции.

Вирусные инфекции

1 Цитомегаловирус CMV

2 Вирусы генитального

и простого герпеса HSV1, HSV2

3 Папиллома вирус HPV16, 18

4 Вирус Эпштейна-барр EBV

5 Вирус гепатита B HBV

6 Вирус гепатита C HCV

Бактериальные инфекции

1 Хламидиоз Chlamidia trachomatis

2 Микоплазмоз Mycoplasma hominis

3 Уреаплазмоз Ureaplasma urealyticum

4 Трихомоноз Trichomonas vaginalis

5 Гоноррея Neisseria gonorrhoeae

6 Гарднереллез Gardnerella

7 Язвенная болезнь Helicobacter pylori

8 Дифтерия Токсигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae

9 Коклюш Bordetella pertussis

10 Туберкулез Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis

11 Стрептококковая инфекция Streptococcus pyogenes

12 Кандидомикоз Candida albicans

Диагностика рака пока ограничивается небольшим количеством сведений о генах, ассоциированных с этим заболеванием. Для развития успешных методов определения рака необходимы дальнейшие исследования мутаций (в т.ч. в рамках программы «Геном человека»), связанных с канцерогенезом. Вообще название «рак» объединяет большое количество разных заболеваний. В каждом конкретном случае, как правило, неизвестна мутация, приведшая к новообразованию, что существенно затрудняет его диагностику.

Диагностика генетических заболеваний, также как и раковых, может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Однако уже сейчас известны гены некоторых генетиче- ских заболеваний, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона. Гены подобных заболеваний обычно начинают работать в возрасте после 70 лет. Поэтому их ранняя диагностика позволит заранее начать лечение, которое в этом случае может быть более эффективным.

Идентификация личности – одно из самых перспективных направлений на рынке ДНК-диагностикумов. Это очень быстрый и точный метод.

СКРИНИНГ БАНКА ГЕНОВ

Скрининг – это поиск специфических клонов в библиотеке, которые несут фрагменты ДНК с последовательностями нужного гена: Поиск нужных генов в смеси клонированных фрагментов ДНК библиотеки.

Один путь заключается в поиске специфической последовательности оснований этого гена (если она известна). Другой путь состоит в поиске специфического белка, кодируемого геном. Есть много методов, зависящих от используемого вектора и гена, который предстоит найти.

1. Если доступен искомый ген, известно его местоположение, молекулярная масса, то его можно выделить путем разделения фрагментов по молекулярной массе и заряду при помощи гель-электрофореза.

Исследуемые образцы (содержащие различные фрагменты одной и той же ДНК) наносят сверху на агарозный или полиакриламидный (ПААГ) гель. При наложении на гель электрического поля фрагменты начнут переме щаться вниз (от отрицательного к положительному полюсу, поскольку молекулы ДНК отрицательно заряжены) со скоростью, зависящей от длины (массы) фрагмента. Чем меньше размер фрагментов, тем быстрее они движутся. В результате электрофореза в геле образуется ряд полос, расположенных одна под другой. Верхние полосы соответствуют фрагментам, имеющим более крупные размеры, а нижние – более мелкие. Полосы выявляются при окрашивании гелей бромистым этидием и просмотре гелей в ультрафиолетовом свете

Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных молекул с известными молекулярными массами. Зная, какую массу имеет фрагмент, содержащий интересующий нас ген, можно выделить его из электрофоретического геля и использовать по назначению.

2. Если известна нуклеотидная последовательность искомого гена, то его поиск в смеси фрагментов ДНК осуществляют с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот (так называемой in situ – гибридизации).

Гибридизация in situ – это отжиг одноцепочечного фрагмента ДНК на комплементарный ему участок другой молекулы ДНК с образованием двухцепочечной гибридной молекулы. Метод предусматривает гибридизацию с ДНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах (т.е. метод гибридизации, не требующий предварительного выделения и очистки ДНК).

Зонды – это искусственно синтезированные меченые (изотопами или флуоресцентными красителями) небольшие (10–30 нуклеотидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК, или ее ДНК-копии), комплементарные искомому гену.

В настоящее время наиболее широко используется FISH (от англ. fluorescent in situ hybridization) — вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченные флуорохромами.

Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНК-зондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек.

1. ДНК-мишень подвергают денатурации тепловой обработкой или щелочью.

2. Полученные одноцепочные ДНК необратимо «пришивают» к твердой подложке (нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр) при высокой температуре.

3. Затем фильтры инкубируют с одноцепочным ДНК-зондом, меченым радиоизотопом или другой меткой. Происходит спаривание комплементарных последовательностей ДНК-мишеней и зондов. Гибридные молекулы обнаруживаются по метке. В качестве нерадиоизотопной метки часто используют биотин, который присоединяют к одному из четырех оснований. На фильтр наносят конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой. Стрептавидин образует комплекс с биотином, который обнаруживается по окраске или люминесценции.

Гибридизация in situ - один из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах.

Применнение:

1. исследование распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК и клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения;

2. определения хромосомной принадлежности и внутрихромосомной локализации уникальных генов,

3. определение взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса.

Гибридизация in situ молекул РНК с кДНК-зондами, проводимая на гистологических препаратах, эффективно используется для анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК.