Бактериологический диагноз

Бактериоскопии и другие методы экспресс-диагностики

Наиболее подходящим материалом для выявления туберку­лезной палочки служит мокрота. Кроме того, в зависимости от локализации процесса исследуют мочу, кал, спинномозговую жидкость, экссудат из полостей, биоптаты тканей.

Открытый туберкулез легких — одна из немногих инфекций, при которых чрезвычайно полезна микроскопия материа­ла, полученного от больного. Это классический образец экс­пресс-диагностики (т. е. микробиологического анализа без вы­деления чистой культуры), которая в данном случае строится на тинкториальном своеобразии возбудителя, а именно — на его устойчивости к обесцвечиванию кислотами. Кроме окраски по Цилю—Нильсену, используют флюорохромные красители (аурамин, родамин), исследуя препараты под малым увеличением люминесцентного микроскопа. Это позволяет быстро просмот­реть большое число полей зрения и тем самым усилить чувст­вительность метола. И все-таки без дополнительных ухищрений разрешающая способность бактериоскопии довольно низка (в 1 мл должно быть не меньше 100 000 микробных тел). Чтобы сде­лать метод более надежным, бактерии концентрируют, т. е. по­вышают их содержание в единице объема. Для этого мокроту, обработанную щелочью, подвергают центрифугированию или флотации (после добавления ксилола/бензола и тщательного встряхивания микобактерии, богатые липидами, всплывают вместе с пеной) Можно поступить еще проще, сделав толстый мазок путем последовательного наслоения—подсушивания не­скольких капель мокроты. Используя эти приемы, положитель­ный результат удается получить при содержании 5000—10 000 бактерии в 1 мл мокроты. Это гораздо ниже чувствительности культурального метола, но компенсируется быстротой, доступ­ностью, а главное, эпидемиологической значимостью анализа. Дело в том, что положительный результат говорит о массивном выделении возбудителя, отражая опасность больного для окру­жающих. По этому признаку туберкулезных больных делят на "бациллярных" и "абациллярных", подразумевая, что именно первая группа требует особенно пристального внимания [8]. Этиотропная терапия, снимающая "бациллярность", делает больного практически незаразным.

Неоднократно предпринимались попытки заменить или хо­тя бы "усилить" бактериоскопию другими методами экспресс-диагностики. С этой целью испытывались различные способы выявления антигенов и специфических метаболитов туберкулезной палочки. За немногими исключениями (например, оп­ределение туберкулостеариновой кислоты в спинно-мозговой жидкости и мокроте), они не принесли удовлетворения из-за плохой воспроизводимости или малой чувствительности [33]. Одно из новейших направлений в диагностике туберкулеза ос­новано на выявлении генетических маркеров (специфических последовательностей ДНК) М. tuberculosis с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1, 6, 33]. Чувствительность ПЦР составляет 70—90% от культурального метода, даёт положитель­ный результат с 90—95% образцов мокроты от "бациллярных" больных и позволяет подтвердить диагноз у 50—60% "абациллярных" больных [33]. Одна из технических трудностей ПЦР связана с ингибиторами ДНК-полимеразы, которые могут при­сутствовать и исследуемом материале.

Культуральный метод

Максимальной чувствительностью (если не считать зараже­ния мокротой морских свинок — способ, который сегодня с ди­агностическими целями не используется) обладает культуральный метод, основанный на выделении и идентификации чистой культуры туберкулезной палочки. Он позволяет обнаружить 20— 100 бактерий в 1 мл исследуемого материала. Для подавления со­путствующей микрофлоры мокроту деконтаминируют, пользуясь устойчивостью микобактерий к кислотам, щелочам и дезинфектантам. Обработанную пробу засевают на специальные питатель­ные среды и инкубируют не менее 8 нед., наблюдая за динамикой роста. Культуры идентифицируют по характерным свойствам, спектр которых довольно широк — от культуральных и морфотинкториальных признаков до спектра миколовых кислот и гене­тических маркеров. Неспособность к пигментообразованию и медленный рост позволяют отличить М. tuberculosis от большин­ства нетуберкулезных микобактерий. Позитивный ниациновый тест (в нем учитывается накопление в культуре ниацина, т. е. ни­котиновой кислоты) дифференцирует М. tuberculosis от М. bovis и беспигментных медленно растущих микобактерий. Редкие ниациннегативные изоляты М. tuberculosis могут быть распознаны по восстановлению нитратов [33].

Большинство штаммов М. tuberculosis вырастают в течение 4 нед., но возможна отсрочка (до 12 нед. и более), особенно при исследовании материала от больных, леченных антитуберкулезными препаратами. Благодаря высокой чувствительности культуральный метод остается "золотым стандартом", т. е. точкой oтсчета для суждения о разрешающей способности других мето­дов. По возможны и парадоксы, когда отрицательный результат сочетается с позитивной бактериоскопией мокроты, а тем более ПЦР. Это связано с гибелью микобактерий при деконтаминации или с утратой способности к размножению под влиянием химиопрепаратов. Первую причину удается сгладить, подняв специфичность деконтаминируюших процедур. Для этого поль­зуются "мягким" обеззараживанием мокроты или культивируют ее в присутствии антибиотиков, которые подавляю! размноже­ние других бактерий, не влияя на рост туберкулезной палочки.

Принципиальный недостаток культурального метода — мед­ленный рост микобактерий туберкулеза, и отсюда — запоздалые результаты. С этим предложено бороться с помощью остроум­ного метода микрокультур (метод Прайса). Его суть в том, что мазки, приготовленные и подсушенные на предметных стеклах (как для микроскопии), на несколько минут погружают в 5% раствор серной кислоты (деконтаминация) и после отмывания культивируют в жидкой питательной среде. Микроколонии, вы­являемые при окраске по Цилю—Нильсену, достигают макси­мальных размеров к 7—10-му дню, хотя нередко видны уже че­рез 3—4 сут. Есть даже предложение (впрочем, спорное) судить по виду микрокультур о болезнетворности туберкулезной па­лочки: вирулентные штаммы, обладающие корд-фактором, об­разуют змеевидные микроколонии типа жгутов/кос, авирулентные растут в виде аморфных скоплений. Метод Прай­са и его модификации не стали стандартной процедурой, так как лишены точности классического культурального анализа.

Предлагались и более изощренные способы ускоренной идентификации растущих культур, основанные, например, на измерении радиоактивного углекислого газа (¹³СО₂), который высвобождается микобактериями туберкулеза из меченной ¹³С пальмитиновой кислоты. Внедрение подобных методов в широ­кую практику остается проблематичным, так как сопряжено с немалыми техническими трудностями и расходами.