- •Туберкулез (микробиологические и иммунопатогенетические аспекты)
- •Общая характеристика микобактерий туберкулеза
- •Факторы и механизмы туберкулезного процесса
- •Признаки микобактерий туберкулеза, связанные с высоким содержанием липидов в клеточной стенке
- •4В клинических классификациях туберкулезная интоксикация ("туберкулез без определенной классификации") выделена в особую форму туберкулеза детей и подростков [з].
- •5Микобактерии или их дериваты входят в состав полного адъюванта Фрейнда — классического инструмента экспериментальной иммунологии.
- •Патология
- •Первичный туберкулез
- •Бактериологический диагноз
- •Аллергодиагностика
- •Вакцинпрофилактика
Факторы и механизмы туберкулезного процесса
Взаимоотношения с макрофагами
Чаще всего М. tuberculosis проникает в организм в составе мелкодисперсных аэрозолей. Для возбуждения конфликта с хозяином бактерии должны попасть в альвеолы. Это удастся частицам диаметром 5—10 мкм; при более крупном размере они задерживаются в респираторном тракте и удаляются путем ретроградного мукоцилиарного транспорта. В альвеолах туберкулезная палочка поглощается резидентными (т. е. постоянно присутствующими здесь) макрофагами, взаимоотношения с которыми определяют дальнейшее развитие событий. Неслучайно туберкулез относится к классическим внутримакрофагальным инфекциям, и с этой точки зрения мысль о том, что "туберкулез — болезнь макрофагов" (устное замечание проф. В. В. Пинегина), не выглядит парадоксом.
Признаки микобактерий туберкулеза, связанные с высоким содержанием липидов в клеточной стенке
Признак |
Причина |
Тинкториальные свойства: -неокрашиваемость обычными способами -кислотоустойчивость Медленное размножение
Культуральные свойства (сухие, морщинистые колонии) Спонтанная агглютинация бактерий во взвеси Устойчивость во внешней среде Устойчивость к дезинфектантам
Взаимоотношения с макрофагами: -поглощение -внутриклеточное выживание
-цитотоксичность Особенности иммунитета, иммунопатогенез
|
Слабая проницаемость клеточной стенки
Связывание красителей миколовыми кислотами Низкая скорость внутриклеточной диффузии питательных веществ Высокая гидрофобность клеток
Защита от высыхания Медленное проникновение антисептиков в клетки Высокая гидрофобность клеток Блокада образования фаголизосом, нейтрализация антимикробных факторов, «ускользание» в цитоплазму Повреждение митохондриальной мембраны Иммуноадъювантная активность, CD1-зависимое представление антигенов (гликолипидов) |
Склонность возбудителя к внутримакрофагалыюй локализации наводит на противоречивые размышления. С одной стороны, это логично, если учесть, во-первых, "долгожительство" мононуклеарных фагоцитов (это обеспечивает экологическую стабильность, необходимую медленно размножающимся микобактериям), во-вторых, изоляцию от эффекторов гуморального иммунитета и,
в-третьих, богатые пищевые ресурсы внутри клеток. В то же время нельзя не удивляться тому, что возбудитель выбирает биотоп, который из-за потенциальной опасности неприемлем для большинства микробов. Мы сталкиваемся здесь с одним из удивительных проявлений симбиоза — изощренного и во многом парадоксального.
Способы, благодаря которым внутримакрофагальные паразиты избегают уничтожения, связаны с "ускользанием" от гибельного воздействия фагоцитов. Главными являются следующие условия: 1) незаметное (без активации макрофагов) проникновение в клетку; 2) подавление образования фаголизосом или превращение их в зону, комфортную для бактерий; 3) выход из фагосом в цитоплазму; 4) устойчивость к антимикробным факторам или их инактивация; 5) ослабление чувствительности макрофагов к активирующим сигналам Т-лимфоцитов; 6) снижение антигенпредставляющей функции макрофагов и ослабление реакции цитотоксических Т-лимфоцитов, настроенных на уничтожение зараженных клеток.
В той или иной мере микобактерии используют каждый из этих механизмов. Усредненная картина сводится к следующему. Туберкулезная палочка внедряется и макрофаги после связывания с различными молекулами на поверхности клеток [10, 11, 17. 28]. Главная роль принадлежит микозидам и липоарабиноманнану, которые напрямую воспринимаются клеточными рецепторами. Некоторые из них (например, рецепторы для маннозы) больше представлены на покоящихся (нестимулированных) клетках, а запускаемые через них сигналы не активируют (или слабо активируют) макрофаги [11]. В связи с этим фагоцитоз не сопровождается образованием таких мощных антимикробных факторов, как свободнорадикальные формы кислорода и азота. Есть данные, что это характерно для вирулентных штаммов М, tuberculosis, которые благодаря структурным особенностям липоарабиноманнана (наличие маннозных кэнов па терминальном фрагменте) инициируют "неагрессивный фагоцитоз" [40]. Авирулентные штаммы не столь коварны: они менее охотно взаимодействуют с маннозными рецепторами, теряя часть своего "инкогнито". Впрочем, выводы из модельных экспериментов (хотя и весьма изящных) нелегко проецировать на ситуации in vivo. В распознавание М. tuberculosis включаются и другие компоненты макрофагов, и частности CD 14 и рецепторы для СЗ-фактора комплемента (CR1—CR3). В последнем случае, кроме прямых, имеют значение опосредованные взаимодействия. Они возбуждаются производными СЗ-фактора, которые фиксируются на поверхности бактерий [28]. Этот механизм срабатывает без антител, т. е. через активацию комплемента и альтернативном каскаде. Подспорьем для закрепления на клетках служит и высокая гидрофобность микобактерий, которая обеспечивает неспецифические (рецептор независимые) контакты с макрофагами.
Оказавшись внутри клеток, возбудитель приступает к очередным обезоруживающим акциям. Начать с того, что туберкулезная палочка препятствует слиянию фагосом с лизосомами, где сконцентрирован основной запас антимикробных начал. Этому способствуют защелачивание внутрифагосомальной среды аммонием, который продуцируется микобактериями, и миколовые кислоты, особенно сульфатиды, действующие благодаря высокому отрицательному заряду [22, 28]. Возможен и более откровенный маневр: бактерии прорывают фагосомальную мембрану и выходят в цитоплазму, скрываясь здесь от биоцидных факторов. Скорее всего, это итог совместного действия сульфатидов и корд-фактора, образующих комплексы, токсичные для биомембран [11]. В целом перегрузка микобактериальными липидами — нелегкое испытание для макрофага. Это чревато повреждением жизненно важных клеточных структур, которое может быть смертельным для клетки (цитолиз, апоптоз).
Но и внутри фаголизосом туберкулезные палочки не обречены на гибель [21]. Благодаря мощной липидной оболочке, снискавшей им славу "бронированных чудовищ", микобактерии малочувствительны к биоцидным началам фагоцитов. Их поверхностные гликолипиды (микозиды) сглаживают респираторный взрыв и инактивируют кислородные радикалы, аммоний защелачивает среду, блокируя активность лизосомальных ферментов, а сульфатиды централизуют мембранотропные катионные пептиды [11, 22, 28]. Кроме того, туберкулезная палочка продуцирует факторы с каталазной и пероксидазной активностью, которые повышают ее устойчивость к оксидантному стрессу [32].
Существенную роль в выживании туберкулезной палочки играют сидерофоры — бактериальные факторы, конкурирующие с хозяином за железо [11, 48]. Для микобактерий это особенно важно, так как, будучи аэробами, они должны активно синтезировать железосодержащие ферменты. Макрофаги (наряду с гепатоцитами) являются главным резервуаром железа, избыток которого резервируется в виде ферритина. Содержание железа в альвеолярных макрофагах в 100 раз выше, чем в моноцитах крови, что, безусловно, содействует их колонизации микобактериями туберкулеза. Последние обладают уникальным тандемом сидерофоров — экзохелином и микобактином. Экзохелины (пептиды) извлекают ионы железа из микроокружения и передают микобактинам (липиды клеточной стенки), которые обеспечивают накопление и транспорт железа внутрь бактерии [22].
Резюмируя, следует констатировать, что для выживания внутри макрофагов туберкулезная палочка использует сложную тактику и только совокупность различных приемов обеспечивает ее агрессивность. Этим вирулентные штаммы отличаются oт авирулентных, а также oт других микобактерий. Повторяя туберкулезную палочку по ряду свойств, имеющих отношение к болезнетворности, они лишены их полного набора. Арсенал реально действующих начал неясен и, скорее всего, раскрывается лишь при конфликте с хозяином. Не исключено, что некоторые факторы образуются только внутри зараженных клеток, как это происходит у других бактерий, предпочитающих внутриклеточный образ жизни. Например, сальмонеллы, паразитируя внутри макрофагов, дополнительно экспрессируют более 30 генов [14].
Гаранулема.
Взаимодействие между туберкулезной палочкой и макрофагами инициирует базисный для туберкулеза процесс — воспаление гранулематозного типа. Сама по себе гранулема не уникальна для туберкулеза. Сходные реакции возникают при других хронических инфекциях (бруцеллез, сифилис, системные микозы, лейшманиоз и пр.), а также при внедрении любых трудно метаболизируемых материалов. Ещё Р. Кох обратил внимание на появление гранулем во внутренних органах после введения животным убитых туберкулезных палочек или их дериватов. Такие реакции не перерастают в процесс, так как инъецируемый материал лишен способности к самовоспроизведению.
Зарождаясь тотчас после инфицирования, туберкулезные гранулемы получают мощный импульс с появлением Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к возбудителю. Неспецифическая (доиммунная) гранулема трансформируется в специфическую (постиммунную) гранулему, обретая признаки, характерные для туберкулеза. Именно с этого момента гранулема называется туберкулом.
Подчиняясь диалектике воспаления, гранулема служит не только рычагом саногенеза, но и механизмом повреждения. Вот почему, чтобы понять туберкулезный процесс, необходимо знать факторы, побуждающие гранулему к патогенетически значимой эволюции.
Неспецифическая (доиммунная) гранулема. Первичное заражение макрофагов не проходит бесследно. Добившись права на внутриклеточную репликацию, туберкулезная палочка вызывает их повреждение — пусть незначительное, но достаточное, чтобы стать центром притяжения моноцитов крови, которые, попав в зону инфекции, трансформируются в макрофаги. Главным инструментом первичного повреждения служат, по-видимому, липиды клеточной стенки с мембранотоксическим эффектом. Аппарат пиогенного (нейтрофилзависимого) воспаления после краткой вспышки практически бездействует. На протяжении всего процесса нейтрофилы остаются беспомощными свидетелями развертывающихся событии, располагаясь в небольшом количестве по периферии гранулемы. Если они и проявляют активность, то это, скорее, приносит вред, способствуя протеолизу некротических масс, который выгоден возбудителю (см. ниже).
Объяснение макрофагальной доминанты следует искать, в природе микобактерий. Проникая в клетки, они исчезают из поля зрения эффекторов острого воспаления (комплемента, нейтрофилов, а затем и антител), которое гаснет, не получая стимулов к развитию. Медленное размножение туберкулезных бактерий и отсутствие у них ярких деструктивных начал снижает вероятность острого конфликта и в дальнейшем.
Стимулом к воспалению служит не только ортодоксальное повреждение клеток. Компоненты клеточной стенки (микозиды, сульфатиды, корд-фактор, липоарабиноманнан) побуждают макрофаги к секреции цитокинов и других флогогенных начал, которые, привлекая моноциты, усиливают эффекторные ресурсы гранулемы и дирижируют событиями внутри нее [11, 18, 28, 43]. Кажется странным, но вирулентные штаммы и этом отношении менее активны. Например, есть наблюдения, что их липоарабиноманнан не только не возбуждает, но даже блокирует секреторную реакцию макрофагов [40]. Однако это формальный парадокс. Задержка восплительного процесса способствует опережающему размножению бактерий, невольно содействуя стабилизации инфекта. Имеет значение и то, что туберкулезная палочка (тот же липоарабиноманнан) снижает чувствительность макрофагов к гамма-интерферону, ослабляет HLA-зависимое представление антигенов и пролиферацию Т-лимфоцитов [17, 28].
Так или иначе, но доиммунная гранулема не останавливает инфекцию. Из легких туберкулезная палочка проникает в регионарные лимфатические узлы и далее в кровоток, получая возможность для диссеминации. Этому содействует "сродство" к макрофагам, присутствующим во всех тканях. За редким исключением, дело ограничивается преходящими гранулематозными (в терминологии фтизиатров — "параспецифическими") реакциями, повторяющими картину первичного очага инфекции. Сама по себе бактериемия на этом этапе не опасна, но она создаст условия для персистенции возбудителя и его отсроченной реактивации в различных органах. С клинической точки зрения, доиммунная фаза соответствует инкубационному периоду, так как никаких реальных симптомов здесь не возникает.
Специфическая (постиммунная) гранулема. Стратегическим итогом неспецифической гранулематозной реакции является развитие иммунного ответа против туберкулезной палочки. Реакция стартует в регионарных лимфатических узлах, куда возбудитель и его антигены транспортируются (скорее всего, дендритными клетками) из первичной гранулемы. Дальнейшие события тесно связаны со специфическим воспалением, в основе которого лежит аллергическая реакция на бактериальные антигены. Представления об аллергии как о "необычной" чувствительности к "обычным" (безвредным для нормального, т. е. несенсибилизированного, организма) антигенам зародились именно при изучении болезнетворного начала микобактерий туберкулеза.
Все началось с наблюдений Р. Коха. Он обнаружил, что у инфицированных животных чувствительность к туберкулезной палочке и ее продуктам гораздо выше, чем в контроле. "Феномен Коха" сводится к следующему. При подкожном заражении здоровой морской свинки культурой туберкулезной палочки видимые изменения на месте инъекции в первые дни отсутствуют. Лишь спустя 10—14 дней возникает плотный, изъязвляющийся узелок, который не зажинает вплоть до гибели животного от генерализованного туберкулеза. Но если туберкулезные бактерии (живые, убитые) или их дериваты внести внутрикожно или подкожно зараженной морской свинке, то воспалительная реакция возникает уже через 24—48 ч. Ей сопутствуют общая интоксикация и обострение отдаленных очагов.
Отсроченный ответ при заражении здорового организма объясняется тем, что бактерии, которые размножаются в зоне инокуляции, до определенного момента сохраняют патогенетическую инертность. Ее нарушает сам хозяин, который после иммунологической перестройки провоцирует гиперергическую (аллергическую) реакцию против возбудителя. В этом "повинны" сенсибилизированные Т-лимфоциты, круто изменяющие ход событий. Они превращают доиммунную гранулему в мощный эффекторный аппарат, наделяя его морфологией и агрессивностью истинного туберкула. Гранулема увеличивается в размерах за счет обильного притока новых клеток и объединения соседних бугорков. В ней появляются гигантские многоядерные клетки Ланхганса—Пирогова (результат слияния активированных макрофагов), макрофаги трансформируются и эпителиоидные клетки, центр гранулемы подвергается казеозному (творожистому) некрозу, по периферии накапливаются фибробласты, побуждаемые к секреции коллагена и отграничению зоны конфликта соединительнотканной (фиброзной) капсулой. Зрелый туберкул выглядит как плотный, сероватого (позднее желтоватого) цвета узелок диаметром 1—3 мм, не вылущиваемый из окружающей ткани.
Суть этой феноменологии состоит в Т-зависимой активации макрофагов, которые повышают свою агрессивность против поглощенных бактерий и начинают интенсивно секретировать флогогенные цитокины и другие медиаторы с широким спектром местных и дистантных аффектов [16, 17, 19, 28, 35, 36]. Приток Т-лимфоцитов, сенсибилизированных против туберкулезных антигенов, знаменует кризис воспалительной реакции и фактически провоцирует ее обострение, выводя из двусмысленного (т. е. весьма ненадежного) гомеостаза. Среди Т-цитокинов на главную роль претендует гамма-интерферон, потенцирующий гибель внутримакрофагальных бактерий [11, 17, 28]. Но это, безусловно, не единственный стимул, чем более что в опытах с макрофагами человека гамма-интерферон не только не усиливает гибель туберкулезных микобактерий, но даже способствует их репликации [28]. Не исключено, что это — "инвитровый" курьез. Участие гамма-интерферона в защите человека от микобактерий подтверждают наблюдения о повышенной склонности к туберкулезу и микобактериозам детей с генетическими дефектами гамма-интерфероновых рецепторов [38].
Для уничтожения поглощенных бактерий стимулированные макрофаги применяют тактику активной и пассивной (если такое словосочетание возможно!) агрессии. В первом случае действуют факторы и механизмы с прямым бактерицидным и бактериостатическим эффектом (реактивные метаболиты кислорода и азота, сокращение лабильного пула железа и пр.). Пассивная агрессия связана с гибелью самих макрофагов, которую вызывают цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры), атакующие зараженные клетки. Это лишает туберкулезную палочку удобной среды обитания.
Клетки гранулематозного инфильтрата гибнут и по другой, менее элегантной, но более значимой причине. Речь идет о казеозном некрозе, связанном с недостатком кровоснабжения и быстро растущей гранулеме. Парадокс, но именно это символизирует начало обратного развития событий, так как в зоне казеозного распада большинство микобактерий погибает, не выдерживая аноксии, закисления среды и недостатка факторов питания (прежде всего железа). Массовое отмирание бактерий радикально снижает концентрацию болезнетворного начала, обрывая воспалительную реакцию. Активированные фибробласты секретируют коллаген и, репарируя очаг повреждения, завершают саногенез. Нередко это сочетается с кальцификацией (обызвествлением) туберкула.
Описанные события — результат сбалансированного взаимодействия клеток, тонко чувствующих нарушение тканевого гомеостаза. Специфическая гранулема действует как рычаг иммунитета, от надежности которого зависит вероятность самоизлечения. Ослабление гранулематозной реакции снижает резистентность к возбудителю, содействуя эволюции туберкулезного процесса. Дождавшись сигнала (точнее, сигналов) от Т-лимфоцитов, макрофаги сами становятся мощным источником цитокинов и других медиаторных молекул, определяющих события внутри гранулемы. Одна из центральных позиций принадлежит туморнекротическому фактору а (ТНФ), главным источником которого служат активированные макрофаги [11, 28, 39, 41]. В опытах на животных нейтрализация ТНФ (антителами или растворимыми рецепторами) подавляет рост гранулем, повышая чувствительность к туберкулезной инфекции и ее осложнениям. Это означает, что ТНФ поддерживает непрерывное обновление клеточного состава гранулем, сдвигая баланс в пользу хозяина. Кстати, гипоксия, вносящая решающий вклад в казеозный распад туберкулов, обусловлена не только отставанием ангиогенеза от быстро растущей клеточной массы, но и цитокининдуцированным (прежде всего тем же ТНФ) повышением тромбгенности эндотелия микрососудов [28].
В любом случае эффекторные реалии гранулемы ощутимы лишь с приходом сенсибилизированных Т-лимфоцитов. Принципиально, что рост постиммунной гранулемы сочетается с усилением антибактериальной активности макрофагов. Этого явно не хватает неспецифической воспалительной реакции, тем более что, инициируя синтез флогогенных цитокинов, туберкулезная палочка тут же угнетает бактерицидность макрофагов, снижая коэффициент полезного действия гранулемы. Вот почему Т-лимфоциты следует рассматривать не только как фактор количественного усиления процесса, но и как стимул для его перехода в новое качество — механизм, одинаково важный для сано- и патогенеза.
Деструкция
Па фоне безуспешных поисков специфических туберкулезных токсинов уже в начале XX столетия было постулировано, что болезнетворность туберкулезной палочки связана не с прямым повреждением тканей бактериями, а с их длительным выживанием в организме. Именно к этому свелось большинство исследований по изучению патогенеза туберкулеза.
Как уже говорилось, подобно любой воспалительной реакции, туберкулезная гранулема, исходно нацеленная на саногенез, рождает повреждение с зачатками клинически значимой патологии. Туберкул, эволюционирующий в направлении саногенеза, прорастает фиброзной тканью, т. е. превращается в рубец. Такой исход знаменует успешное завершение борьбы с возбудителем, стартовавшей на доиммунном этапе гранулематозного процесса. Но иногда некроз прогрессирует, а казеозная масса вместо рубцевания подвергается расплавлению протеолитическими ферментами макрофагов и, возможно, нейтрофилов. В такой среде туберкулезная палочка чувствует себя великолепно и, размножаясь, поддерживает альтерацию. Если туберкул, переживающий фазу распада, находится по соседству с бронхами или кровеносными сосудами, они втягиваются в некротический процесс. В подобных случаях возбудитель получает возможность для распространения на другие участки легкого, а, попав в циркуляцию, вызывает обсеменение отдаленных органов с тяжелейшими последствиями (см. ниже). О причинах, сдвигающих баланс в сторону патогенеза, можно только гадать, но они, несомненно, связаны не с прямым действием бактерии, а опосредованы иммунологическими механизмами.
Интоксикация
Интоксикация — одно из обязательных проявлений туберкулеза. Она имеет неспецифический характер, включая такие симптомы, как лихорадка, потливость, ночные поты, ознобы, быстрая утомляемость, слабость, тахикардия, снижение аппетита, исхудание и пр. [3, 8]. Симптомы нарастают вместе с туберкулезным процессом, но иногда возникают без очевидной органной патологии4 Истощение может обретать крайние формы, оправдывая историческое название болезни — "чахотка" (греч. phthisis — истощение: англ. consumption — потребление, истощение).
Интоксикацию удастся воспроизвести на животных с помощью липидных и гликолипидных фракций клеточной стенки микобактерий, в частности того же корд-фактора. Но не это главное. Поиски туберкулезных токсинов привели к неожиданному, но вполне логичному открытию, которое следовало из наблюдений о повышенной чувствительности инфицированного организма к туберкулезной палочке. Путем выпаривания водно-глицериновой вытяжки из культур М. tuberculosis P. Кох приготовил препарат (так называемый "старый туберкулин Коха"), безвредный для нормальных, но токсичный для туберкулезных животных. Его действующим началом оказались белковые дериваты туберкулезной палочки.
Внутрикожное или подкожное введение туберкулина вызывало не только местную воспалительную реакцию, но и общую интоксикацию с обострением очагов туберкулезной инфекции. То же самое наблюдалось у туберкулезных больных, драматично приостановив увлечение туберкулинотерапией. Но препарат оказался полезным в диагностике туберкулеза, и с этой целью его стали применять еще при жизни Р. Коха.
Сегодня мало кто сомневается, что туберкулезная интоксикация имеет опосредованный характер, отражая гиперпродукцию флогогенных цитокинов клетками гранулемы, прежде всего активированными макрофагами. Это, в частности, справедливо для одного из кардинальных признаков хронического туберкулеза — кахексии. Ее связывают с действием ТНФ, который усиливает липазную активность адипоцитов и давно заслужил репутацию "кахектина". В связи с этим, с патогенетической точки зрения, местные повреждения и общую интоксикацию следует считать однотипным процессом. Он базируется на событиях, которые происходят внутри гранулемы и сопровождаются повышением ее местной и общей агрессивности.