Генетика поведения нематод

Одним из удобных объектов для исследования генетических и мо-лекулярно-генетических основ поведения служит червь Caenorhabditis ekgans, введенный в экспериментальную практику Бреннером (Brenner) и характеризующийся значительной простотой своих поведенческих ре-й. Взрослый червь достигает 1 мм длины и состоит всего из 959

у дрозофилы, функционирование гомеозисных генов регулирует про­цесс регионализации нервной системы нематод.

С. elegans имеет цилиндрическое, волосовидное, несегментиро-ванное тело (рис. 7.4), оставляющее на агаре в чашке Петри легко различимый след, который можно регистрировать и анализировать. Эти видимые бороздки в агаре могут проходить вдоль градиента ат-трактантов, вроде химических соединений (циклические нуклеоти-ды), катионы, щелочные значения рН. Характер расположения бо­роздок отражает особенности поведения: ориентацию — движение вдоль градиента концентрации, включая "боковое" движение головы червя. Скопление - постоянное скопление большого числа нематод в какой-либо особой точке градиента. Привыкание — наблюдаемое по­сле того, как контейнер и его содержимое делаются привычными для особи. Этот процесс заключается в ознакомлении животного и с гра­диентом распределения аттрактанта и с самим аттрактантом. Поведе­ние червя изменяется, как только он оказывается в области макси­мального притяжения, затем он покидает ее, чтобы позднее повто­рить весь цикл сначала.

Анализ различных мутантов, характеризующихся дефектами кути­кулы, позволил прийти к выводу, что ориентирование в химическом градиенте обусловливается сенсорными органами, расположенными на голове животного. Мутантные черви со вздутиями в дистальной части хвоста ориентируются нормально, в то время как наличие таких взду­тий на голове делает ориентацию невозможной.

I Личиночное развитие с. Elegans контролируется активностью че­тырех классов хемосенсорных нейронов. При этом выбор между нор­мальным развитием и развитием в специализированную личиночную

клеток, 350 из которых являются нервными клетками. В связи с этим оказалось возможным построить на основании анализа гистологиче­ских срезов трехмерную модель нервной системы этого объекта. Брен­нер индуцировал у С. elegans множество поведенческих мутаций и по­пытался выявить корреляцию поведенческих реакций со структурными и молекулярными особенностями этих мутантов.

Caenorhabditis elegans - гермафродит, для которого характерно са­мооплодотворение, причем сначала продуцируется и запасается сперма, а затем развиваются и откладываются яйца, около 300 у каждой особи. Продолжительность жизненного цикла при температуре 20° С состав­ляет от 3 до 4 суток. Самооплодотворение способствует возникновению гомозиготности, но у одной и той же особи могут возникать различные индуцированные мутации, поэтому в результате нерасхождения хромо­сом в мейозе постоянно появляется некоторое число самцов (0,1 %), ко­торые при скрещивании с гермафродитами переносят ту или иную му­тацию, которую и используют в качестве генетической метки: А = 1 на

бор аутосом ^а1^а2 особи, редко производящие самцов,

- особи, часто производящие самцов, - самцы.

С. elegans весьма удобна для генетиков поведения, поскольку его легко разводить в лабораторных условиях, он имеет гаплоидный набор из шести хромосом, соответствующих шести группам сцепления.

Развитие этой нематоды своеобразно. Развивающееся яйцо высших эукариот подразделяется на три слоя эмбриональных тканей - эктодер­му, мезодерму и энтодерму, каждый из которых дает начало определен­ным клеточным типам. Например, нервная ткань возникает из эктодер-мальной закладки, эпителий пищеварительной трубки - из энтодер-мальной закладки и т.д. У С. elegans это правило нарушено: некоторые нейроны у них могут развиваться из мезодермы, причем клетка-пред­шественник может делиться, продуцируя одну дочернюю клетку, пре­вращающуюся в нейрон (обычно производный эктодермы), и другую-дающую начало мышечной клетке (обычно производную мезодермы). Следовательно, эмбриональные ткани нематоды характеризуются большей пластичностью, нежели у других высокоорганизованных эука­риот (рис. 7.3).

Кроме того; у С. elegans довольно высок процент клеток, подвер­женных апоптозу в ходе нормального развития: одна из каждых шести клеток генетически запрограммирована к гибели. Эта гибель полоспе-цифична, так что гибель одной клетки у эмбрионов одного пола не оз­начает, что погибнут гомологичные клетки у эмбрионов другого пола.

Симметрия у С. elegans также формируется своеобразно, порой не в результате симметричного деления клеток, но благодаря их активным перемещениям.

Как и у других организмов, важную роль в развитии нематод игра­ют гомеозисные гены. У С. elegans, например, у мутантов по локусу/й-12 нарушено развитие вульвы, эти мутанты стерильны. Вероятно, как!

форму, называемую "dauer larva", питающуюся и способную пережи­вать без пищи несколько месяцов, регулируется конкурирующими сре-довыми стимулами: пища и "dauer pheromon". Когда убиваются нейронь классов ADF, ASG, ASI и ASJ, животные развиваются как "dauer" ли­чинки независимо от средовых условий (рис. 7.5). Анализ мутантов, де­фектных по "dauer formation" показывает, что хемосенсорные нейроны активны в отсутствие сенсорных входов и что dauer феромон тормозит способность этих нейронов генерировать сигналы, необходимые дл» нормального развития.

Одной из самых распространенных поведенческих моделей, исполь­зуемых для анализа генетики поведения С. elegans, является пищевое! поведение. Его фаринкс является пищевым насосом, состоящим из треп частей: (1) тело (corpus), которое поглощает (ingest) бактерий и (2) isth­mus, который проводит бактерий к (3) terminal bulb, где бактерии разма-1 лываются и проводятся в кишку (рис. 7.4, Ь).

Фаринкс окружен базальной мембраной и содержит 80 клеток, 201 из которых - нейроны фарингеальной нервной системы (гомолог инт-1 рамуральной нервной системы пищеварительной трубки позвоночных), I Эта система связана с остальной нервной системой парой нервов. Нал-1 чие автономной иннервации позволяет фаринксу нормально функцио-1 нировать в случае его изоляции in vitro.

Только один из 20 нейронов (М4) существен для жизни. Он иннер-1 вирует задний isthmus, и в случае его отсутствия isthmus остается закры­тым, а бактерии не транспортируются для размалывания и переварива­ния, так что животное голодает. Черви с интактным М4 нейроном и от­сутствующими 19 другими жизнеспособны, хотя эти нейроны необходе-мы для нормального паттерна питания.

чать на такие специфичные для них запаховые раздражители как диаце-тил и пиразин. Они неспособны также экспрессировать ген odr-Ю. Ес­ли в геном нулевых по odr-7 мутантов ввести ген odr-Ю под активным промотором, экспрессирующимся в AWA и AWC нейронах, то восстана­вливается хемотаксис к диацетилу, но не к пиразину. Таким образом, наличие белка ODR-Ю достаточно для ольфакторного ответа на диаце-тил, так что данный белок, вероятно, является рецептором к диацетилу. В последнее время идентифицированы гены, контролирующие ней-рогенез у С. elegans: тес-3, определяющий наподобие гена cut Drosophila специфичность типа нервной клетки и гены ипс-5, ипс-6, ипс-40, наподобие гена fas-1 Drosophila, контролирующие характер роста нервных отростков. Еще один ген ипс-4 регулирует специфику форми­рования синаптических контактов VA мотонейронов. У соответствую­щих мутантов локомоторный дефект коррелирует со специфическими изменениями синаптических связей нейронов этого типа (рис. 7.6).

Оказалось, что еще один ген - ипс-4 кодирует гомеодоменовый бе­лок, который функционирует как транскрипционный фактор. Эффект этого гена на развитие соответствующих нейронов экспериментально доказан. Он изменяет паттерн синаптических входов к одному классу моторных нейронов вентральной нервной трубки. У мутантов ипс-4(е120), которые характеризуются отсутствием функционирования гена ипс-4, пресинаптические партнеры VA нейронов замещаются интерней­ронами, соответствующими мотонейронам VB класса. Эти измененния нейральной специфичности не сопровождаются сколько-нибудь замет­ными дефектами нейральной морфологии или нарушениями роста от-

Леон Эйвери (Avery) изолировал и охарактеризовал гены, которые контролируют присутствие или отсутствие, паттерн иннервации и функции 20 нейронов, ответственных за пищевое поведение. Было об­наружено 35 генов, локализованных во всех 6 хромосомах, и предпола­гается, что имеется еще столько же, отвечающих за данную форму по­ведения. Выявленные этим ученым 52 мутации по своему фенотипиче-жому эффекту можно разделить на три группы. Мутанты eat действу­ют на подвижность фарингеальных мышц и, кроме того, на функциони­рование мышц стенки тела. Многие мутанты этого типа вызывают на­рушение функций некоторых нейронов.

Мутанты pha вызывают дефекты фаринкса, которые предотвраща­ют нормальное пищевое поведение и часто вызывают дефекты в мор­фогенезе и клеточной спецификации.

Третий класс мутантов (phm мутанты) обусловливают слабые или нерегулярные сокращения фарингеальных мышц. Они могут также на­рушать нейральный контроль мышечной функции.

У Caenorhabditis обнаружены также система генов, контролирую­щих развитие хеморецепторов, которые реагируют на водораствори­мые аттрактанты (биотин, лизин, сАМР, ионы натрия и хлора), летучие репелленты (октанол), летучие аттрактанты (диацетил, пиразин, иниа-зол, бензальдегид, изоамиловый спирт, тиазол), а также температурных рецепторов. Было идентифицировано более 40 генов, кодирующих трансмембранные рецепторы. Эти "рецептороподобные" гены можно подразделить на 6 семейств (sra, srb, srg, srd, sre, sro), основываясь на сходстве последовательностей их ДНК. Однако не было найдено сход­ства с другими известными последовательностями ДНК, кодирующими трансмембранные рецепторы, за исключением слабой гомологии sro гена с генами опсина. Гены одного и того же семейства часто собраны в один кластер. Некоторые из этих кластеров могут ко-экспрессиро-ваться наподобие оперонной системы, однако в некоторых случаях ге­ны из одного кластера экспрессируются в разных нейронах. Предпола­гается, что в целом геноме С. elegans содержится более 100 генов, экс-прессирующихся в хеморецепторах. Поскольку С. elegans имеет 32 хе-мосенсорных нейрона, сводимых в 14 типов, можно думать, что каждый хемосенсорный нейрон экспрессирует несколько хеморецепторов. Бы­ло, в частности, обнаружено, что один тип хемосенсорных нейронов, так называемый ASK характеризуется активностью по крайней мере четырех различных "рецепторо-подобных" генов, принадлежащих к разным субсемействам (sra-7, sra-9, srg-2, srg-8). Генетические и молеку­лярные исследования гена odr-10 показали, что взаимодействие отдель­ного одоранта со сцепленным с трансмембранным доменом G-белком инициирует ольфакторную трансдукцию. Ген odr-10 кодирует транс­мембранный белок, который экспрессируется только в сенсорных рес­ничках нейронов типа AWA. Ген odr-7 кодирует транскрипционный фа­ктор, который принадлежит к суперсемейству ядерных рецепторов и специфически требуется для осуществления сенсорной функции AWA. Нулевые мутанты по этому гену не препятствуют структурной диффе-ренцировке этих нейронов, однако последние теряют способность отве-

обычно девственным самкам. Оплодотворенная самка пресекает по­пытки ухаживания самца, препятствуя копуляции выпячиванием яйце­клада. Существенную роль в осуществлении ритуала ухаживания игра­ют ольфакторные, зрительные и звуковые сигналы.

Основным пусковым сигналом для инициации ухаживания являют­ся ольфакторные сигналы (феромоны). Если из девственных самок вы­делить органический экстракт, то самцы, воспринимающие летучие компоненты такого экстракта, начинают ухаживать друг за другом. Ус­тановлена химическая природа этого феромона, он оказался гептакоза-диеном. Оплодотворенные самки выделяют "отталкивающий" феро­мон. Американский генетик Роллин Ричмонд (Richmond) предполагал, что это продукт разрушения содержащегося в семенной жидкости цис-вакценилацетата специфической эстеразой самца, кодируемой геном est6 и передаваемой при копуляции самкам. И еще одно вещество тор­мозит ухаживание самцов за уже оплодотворенными самками — углево­дород 7-трикоцен, передаваемый самцом самке, после чего она начина­ет его выделять, подавляя ухаживание самца. Уровень содержания три-коцена у девственных самок составляет 20 нг, после оплодотворения он достигает 60-70 нг.

Л.З. Кайданов отселекционировал линии дрозофилы с высокой и низкой половой активностью. Оказалось, что активность тканеспеци-

ростков. Предполагается, что ген ипс-4 регулирует экспрессию неболь-1 шого числа генов-мишеней, и продукты этих генов включены в процесс I формирования специфического синаптического паттерна.

Простота организации С. elegans позволяет изучать и молекулярно-1 генетические аспекты нейрохимических особенностей этого объекта. ВI частности, были выполнены детальные исследования роли G-белка (гу-1 анин нуклеотид-связывающего белка), играющего ключевую роль в I модулирующей активности нейронов и мышц, в изменении серотонлн-1 контролируемого поведения С. elegans. Оказалось, что мутация гена I goa-1, кодирующего альфа-субъединицу, вызывает дефекты в поведе-1 нии, сходные с таковыми у мутантов, которые утрачивают нейротранс-миттер серотонин (5-НТ), при этом goa-1 мутанты частично резистент-1 ны к экзогенному 5-НТ. Мутантные животные, утратившие альфа-субъединицу белка G, и трансгенные животные, характеризующиеся гиперэкспрессией соответствующего гена (мутация goa-l\xs)), имеют реципрокные дефекты в локомоции, питании и откладывании яиц. У мутантов наблюдаются гиперактивные движения, откладывание яиц и I импотенция самцов, у трансгенных животных эти дефекты "исправля­ются". Известно, что у нормальных животных все эти события регули­руются 5-НТ. Следовательно, белок G опосредует у С. elegans многие поведенческие эффекты серотонина.