1. Определение редукции нитратов

Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов

восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) до солей азотистой

кислоты (нитриты) и далее до последующих продуктов восстановления

(аммиак, молекулярный азот, окись азота, гидроксиламин). Редукция

нитратов в нитриты определяется с помощью реактива Грисса, а

газообразные продукты - с помощью поплавка.

Ингредиенты:

бактопептон,

калий азотнокислый (KNO3),

сульфаниловая кислота,

альфа-нафтиламин,

уксусная кислота - 5 моль/л,

цинк металлический.

Приготовление нитратного бульона. Берут KNO3 - 1,0 г;

бактопептона - 5,0 г; добавляют воды дистиллированной до 1000 мл,

рН 7,4. Нитратный бульон разливают в химически чистые пробирки с

поплавками по 5 мл. Автоклавируют при 0,5 атм. (115°С) в течение

20 минут.

Приготовление реактива Грисса. Раствор 1. 0,8 г сульфаниловой

кислоты растворяют в 100 мл 5 моль/л уксусной кислоты при слабом

нагревании.

Раствор 2. 0,6 г альфа-нафтиламина растворяют в 100 мл 5

моль/л уксусной кислоты при слабом нагревании.

Растворы хранят в посуде из темного стекла с притертыми

пробками. Перед употреблением 1 и 2 растворы смешивают в равных

объемах.

Ход исследования. Перед посевом в среду добавляют 20%

инактивированной сыворотки. Посевы выдерживают в термостате при

37°С до 5-7 дней.

После инкубации в каждую пробирку с культурой вносят реактив

Грисса по 0,1 мл.

Оценка результатов. Появление красного окрашивания через 30

секунд после добавления реактива Грисса свидетельствует о редукции

нитратов до нитритов - реакция положительная. Отсутствие

окрашивания свидетельствует о том, что реакция отрицательная или

произошло восстановление до последующих продуктов. Поэтому при

отсутствии окрашивания в пробирку добавляют на кончике скальпеля

порошок металлического цинка и результат оценивают: окраска не

проявляется - нитраты в среде отсутствуют, т.к. редуцированы

бактериями до нитритов и далее - до последующих продуктов

восстановления (реакция положительная); появляется красное

окрашивание - нитраты в среде редуцированы до нитритов, но не

бактериями, а цинком (реакция отрицательная).

2. Определение редукции нитритов

Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов

восстанавливать соли азотной кислоты (нитриты) до аммиака,

гидроксиламина, окиси азота, двуокиси азота, молекулярного азота.

Ингредиенты:

бактопептон,

калий азотистокислый (KNO2),

сульфаниловая кислота,

альфа-нафтиламин,

уксусная кислота - 5 моль/л.

Приготовление нитритного бульона. Берут калий азотистокислый

(KNO2) - 0,2 г, добавляют бактопептона - 5,0 г, воды

дистиллированной - до 1000 мл, рН 7,4. Нитритный бульон разливают

в химически чистые пробирки с поплавками по 5 мл. Автоклавируют

при 0,5 атм. (115°С) в течение 20 минут.

Приготовление реактива Грисса (см. определение редукции

нитратов).

Ход исследования. Перед посевом в среду добавляют 20%

инактивированной сыворотки. Посевы выдерживают в термостате при

37°С в течение 5-7 дней. После инкубации в каждую пробирку с

культурой вносят реактив Грисса (по 0,1 мл смеси равных объемов

реактивов 1 и 2, которые смешивают непосредственно перед

употреблением).

Оценка результатов. Красное окрашивание - реакция

отрицательная; отсутствие красного окрашивания указывает на

восстановление нитритов - реакция положительная; наличие газа в

поплавке при отсутствии окрашивания, редукция нитритов до

газообразных компонентов - реакция слабоположительная.

3. Определение желатиназы (см. раздел 2.5.)

2.4. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ

МИКРОБОВ РОДА ГЕМОФИЛУС (Haemophilus)

Род гемофилус (Haemophilus) по международной классификации

бактерий (Берги, 1980) охватывает двадцать разнообразных видов

мелких неподвижных не образующих спор грамотрицательных палочек.

Наибольший удельный вес среди заболеваний человека, вызываемых

гемофилами, принадлежит палочке инфлюэнцы (Haemophilus

influenzae). Этот микроб, как потенциальный возбудитель,

выделяется от больных при острых, реже хронических, заболеваниях

верхних и нижних дыхательных путей (ринитах, синуситах,

фарингитах, трахеитах, эпиглосситах, бронхитах, пневмониях,

абсцессах, эмпиемах), гнойных менингитах, эндокардитах, сепсисе,

воспалениях суставов. H. aphrophilus выделяется при подострых

эндокардитах человека; H. aegyptius является причиной тяжелых

остро протекающих конъюнктивитов; H. parainfluenzae, H.

haemolyticus, H. parahaemolyticus - нормальные обитатели

респираторного тракта человека, но при определенных условиях

первые два вида могут вызывать эндокардиты, а после вирусных

инфекций - вторичные острые заболевания ротовой полости, глотки,

трахеи и бронхов. H. ducreyi вызывает мягкий шанкр - венерическое

заболевание с четко выраженной клинической картиной. Для

диагностики мягкого шанкра применяют в основном микроскопическое

исследование содержимого язвы. H. ducreyi - грамотрицательная

палочка с характерным расположением в мазках - в виде длинных

параллельных цепочек. Форма палочек напоминает восьмерку, челнок;

иногда наблюдается полиморфизм. Бактериологическое исследование

при мягком шанкре применяют очень редко, процент положительных

результатов невысок, биологические свойства микроба изучены

недостаточно.

Микробы рода гемофилов, особенно Н. influenzae, чаще являются

причиной заболеваний детей раннего и лиц пожилого возраста,

вторичных бактерийных инфекций у больных, ослабленных хроническими

соматическими, онкологическими заболеваниями.

При культивировании на искусственных питательных средах

гемофилы нуждаются в факторах X и V, источником которых является

свежая кровь человека и животных. По потребностям в указанных

факторах при росте на искусственных питательных средах различные

представители гемофилов дифференцируются внутри рода (см. табл.