ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ

«ОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

______________________________________________________________________

Кафедра ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животного происхождения и гигиены сельскохозяйственных животных

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К лабораторным занятиям по дисциплине «Ветеринарно-санитарная экспертиза и гигиена воды, кормов и кормовых добавок» на тему:

«Микробиологический и микологический анализ кормов»

Для подготовки студентов по специальности

Ветеринарно-санитарная экспертиза-110501

и бакалавров – направление-110500

Рекомендованы методической комиссией специальности

ветеринарного факультета ИВМ ОмГАУ

ОМСК 2006

Автор:

к.в.н., ассистент К.В. Порошин

Ответственный за выпуск: д.б.н., профессор, зав. кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животного происхождения и гигиены сельскохозяйственных животных М.В. Заболотных.

Рецензент:

1. В.И. Плешакова д.в.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии ИВМ ОмГАУ.

Содержание

1. Микробиологический анализ кормов…………………………………….4

1.1. Материалы и оборудование…………………………………………..4

1.2.Общие сведения………………………………………………………..4

1.3. Определение микробной обсемененности…………………………..4

1.3.1. Пример расчета………………………………………………..5

1.4. Исследование на сальмонеллы……………………………………….6

1.5. Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки…….8

1.6. Исследования на анаэробы…………………………………………...9

2. Микологический анализ кормов……………………………………...…12

2.1. Микроскопирование…………………………………………………12

2.2. Характеристика плесневелых грибов……………………………....12

2.2.1. Грибы, паразитирующие на живых растениях………………12

2.2.2. Грибы, паразитирующие на убранных кормах……………...12

2.3. Определение спор головневых грибов……………………………..17

2.4. Определение спорыньи в комбикормах……………………………18

2.5. Профилактика микозов и микотоксикозов…………………….......19

2.6. Профилактика поражений растений ржавчинными грибами…….19

2.7. Профилактика поражений злаковых спорыньей и головней……..19

2.8. Профилактика фузариотоксикозов………………………………....20

2.9. Профилактика стахиботриотоксикоза………………………...........20

3. Контрольные вопросы…………………………………………………...21

4. Список литературы………………………...…………………………….22

Микробиологический анализ кормов

Материалы и оборудование. Лабораторные весы; термостат; шуттель-аппарат; эксикатор; стерильные пробирки; пипетки; чашки Петри; фарфоровые ступки; ватно-марлевые фильтры; питательные среды (мясо-пептонные бульон, агар, желатин, пептонная вода, висмут-сульфит-агар, селенитовый бульон, магниевая среда, среды с мочевиной, глюкозой и сернокислым железом, углеводами и индикатором Андраде в сочетании с тимоловым синим, цитратно-аммонийная среда, мясо-пептонный желатин, среды Вильсона— Блера, Киллиана, Китта—Тароцци, Кларка, Левина, Плоскирева, Ресселя, Эндо, Эйкмана, кровяной агар по Цейслеру, бульон Хот-тингера, молоко, печеночный бульон); физиологический раствор; индикаторные бумажки; лабораторные животные (белые мыши, морские свинки).

Общие сведения. От каждой партии корма отбирают две средние пробы массой не менее 500 г. Одну направляют в лабораторию, другую сохраняют в хозяйстве до окончания исследования. Для упаковки проб используют стерильную пластмассовую или стеклянную тару.

В пробах корма определяют общую микробную обсемененность, содержание сальмонелл, энтеропатогенных типов кишечной палочки, анаэробов.

Определение микробной обсемененности. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из средней пробы, добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1:10). Из взвеси готовят последующие разведения (1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000 и т. д.). После осаждения взвешенных частиц для посевов берут жидкость из верхнего слоя.

Для количественного учета микробов в стерильные чашки Петри вносят по 1 мл из пробирок с разным разведением и доливают 10— 15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44—45 °С мясо-пептонного агара (МПА). Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37 ⁰С на 24—48 ч. После этого подсчитывают выросшие колонии. Полученные результаты умножают на степень разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корма.

Пример расчета. В первой чашке обнаружено 200 колоний, во второй — 21, в третьей — 1. В эти чашки посевной материал брали из пробирок с разведениями соответственно 1 : 10 000, 1 : 100 000,1 : 1000 000. Следовательно, в 1 г корма будет содержаться

200 * 10 000 + 21 * 100 000+1 * 1 000 000 : 3 = 1,7 млн микробов.

Микробную обремененность мясо-костной муки можно определить экспресс-методом с применением резазурина. Для этого в одну стерильную пробирку помещают 1 г средней пробы мясо-костной муки, добавляют 10 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) и встряхивают, а в другую пробирку (для контроля) вносят только 10 мл МПБ. Пробирки помещают в термостат при 40 °С на 3 ч. После этого в них добавляют по 1 мл 0,01 %-ного раствора резазурина и вновь выдерживают в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакций учитывают через каждые 30 мин. По восстановлению резазурина (изменению окраски из синей в розовую) определяют общую микробную обсемененность мясо-костной муки. Если в пробирке с мясо-костной мукой розовое окрашивание наступает позднее чем через 2 ч, то это говорит о том, что в 1 г продукта содержится до 500 тыс. микробов, а при окрашивании в розовый цвет до 2 ч — более 500 тыс. микробов.

Контролем служит пробирка с 10 мл МПБ и 1 мл 0,01 %-ного раствора резазурина, выдержанная в термостате при том же температурном режиме и экспозиции и без изменения цвета содержимого.

Исследование на сальмонеллы. Для анализа берут 50— 200 г исследуемого корма, измельчают его в стерильной фарфоровой ступке и переносят в колбу со средой предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5 % маннита) при соотношении материала и среды 3 : 5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16—18 ч материал высевают в чашки Петри на твердые дифференциально-диагностические среды (висмут-сульфит-агар, среда Плоскирева или Левина) и на две основные среды обогащения (селенитовый бульон, среда Киллиана в соотношении 1:3).

После 16—18 ч выдержки в термостате при 37 °С из сред обогащения делают вторично посевы в чашки с висмут-сульфит-агаром и в чашки со средами Плоскирева и Левина (по выбору) и ставят их в термостат при 37 °С.

Чашки просматривают через 16—24 и 48 ч.

На висмут-сульфит-агаре S. typhi и S.paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром, S. cholerae suis — в виде зеленых колоний. Колонии всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета, с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией черный. На среде Плоскирева вырастают прозрачные или нежно-розовые колонии, на среде Левина — прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые.

В случае обнаружения колоний, похожих на сальмонеллы, 3—5 из них высевают на комбинированную среду Ресселя или скошенный агар с мочевиной и бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода (под пробирки с бульоном подкладывают специальные индикаторные бумажки). Для определения подвижности культуры делают посев уколом в полужидкий агар (0,3—0,5%-ный).

На среду Ресселя и скошенный агар посевы делают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Если разлагается мочевина в скошенном агаре, то окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе ВР и на коричнево-фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикатором Андраде.

Морфологию культуры изучают в мазках, окрашенных по Граму, и подвижность — в висячей или раздавленной капле или полужидком агаре. Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, исследуют серологически — испытывают в реакции агглютинации (РА) на предметном стекле с набором агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сыворотки (группы, А, В, С, D, Е).

Для РА с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками — из нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны. По групповой О-сыворотке устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе.

Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиологического раствора, встряхивают на шуттель-аппарате в течение 20 мин. Из полученной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000, 1 : 100 000, 1 : 1 000 000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки со средой Эйкмана. Посевы помещают в термостат при температуре 43 °С. Через 24 ч учитывают рост по помутнению среды и образованию газа. Титр кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в котором еще наблюдался ее рост.

Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциальные среды (Эндо, Левина, Плоскирева), разделенные на секторы для каждого разведения.

Типичные колонии Е. coli круглой формы, гладкие, выпуклые или слегка приподнятые в центре с ровными краями розового, красного или малинового цвета, с металлическим блеском или без него на среде Эндо или черного цвета на среде Левина.

Выросшие изолированные колонии S-формы (не менее 4) пересевают на МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16—24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посевов на дифференциальные диагностические среды, заражения мышей; вторую — для приготовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглютинироваться поливалентными (комплексными) коли-сыворотками.

У выделенных культур определяют морфологические и культурально-биохимические свойства для установления их родовой принадлежности. Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, их подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА.

Для определения культурально-биохимических свойств бактерий используют набор питательных сред (с углеводами и индикатором Андраде, цитратно-аммонийную, мясо-пептонный желатин, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом).

Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. Для этого трем мышам массой 14— 16 г внутрибрюшинно вводят смывы с суточных агаровых культур в дозе 500 млн микробов. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые 4 сут после заражения.

Исследования на анаэробы. 50 г корма растирают в стерильной ступке, разводят физиологическим раствором и засевают в несколько пробирок со средой Китта—Тароцци, Вильсона—Блера, молоком и в две чашки со средами и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничтожения вегетативных форм микробов по одной пробирке с жидкими средами нагревают при температуре 80°С в течение 20 мин. Посевы помещают в термостат при температуре 37 ⁰С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной поглотитель кислорода.

Результаты посевов регистрируют в тот же день. Почернение среды Вильсона—Блера в течение 1 —3 ч после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 ч, а также быстрое начало роста на среде Китта—Тароцци (через 4—5 ч) при обильном газообразовании — харак­терные признаки присутствия возбудителей Cl. perfringens.

Рост Cl. botulinum, наблюдаемый обычно на 2—3 сут, характеризуется помутнением среды Китта—Тароцци, образованием осадка и появлением запаха прогорклого масла.

При обнаружении роста на среде Китта—Тароцци проводят микроскопическое исследование и выделение чистой культуры посевом в 2—3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру. Последние выдерживают в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24— 48 ч, после чего просматривают рост в чашках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам.

Биологическую пробу ставят на морских свинках или белых мышах, вводя внутрибрюшинно бульонную культуру. При положительном результате подопытные животные погибают через 12—48 ч.

Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида проводят опыт нейтрализации токсина со специальной сывороткой. Для этого минимальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2—0,5 мл соответствующей типоспецифической сыворотки выдерживают в термостате 45 мин и вводят мышам внутрибрюшинно. Для контроля испытуемую культуру или фильтрат применяют без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей.

При исследовании кормов на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа:

а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в стерильной ступке, добавляют физиологический раствор (1 : 4) и настаивают в течение 1—2 ч при комнатной температуре. После этого настой центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К 0,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдерживают 1 ч при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому — смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе.

Аналогичные испытания могут быть проведены чистой культурой, выращенной (в течение 6—7сут) на печеночном бульоне. В этом случае пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой культуры и пропускают через ватно-марлевый фильтр. Далее поступают, как указано выше;

б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Фильтрат готовят, как указано в подпункте «а». Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 мин. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5—1 мл некипяченого фильтрата, другому — такую же дозу кипяченого.

Положительным результатом биологической пробы по первому и второму способам считают гибель мышей, наступившую как от фильтрата, не обработанного противоботулиновой сывороткой, так и от некипяченого фильтрата.