7. Молекулярно-биологические методы в экологии

Лирическое отступление. Биологам лучше не смотреть, наверное) Создано по мотивам лекций и википедии, довольно много отсебятины. Если все-таки решили почитать и нашли косяки – давайте публично исправлять)

Применение методов, основанных на достижениях молекулярной биологии, позволяет подойти к изучению микробных сообществ не с «точки зрения» чистых культур, а достаточно полного видового состава сообщества и, как следствие, возможных взаимодействий в нем. Проблема (в случае с чистыми культурами) кроется в некультивируемых группах, которые можно изучить лишь прямыми методами.

Учет видов молекулярными методами основан на амплификации участка ДНК, кодирующего последовательность нуклеотидов в 16S-РНК. После чего организм относят к тому или иному виду при помощи банка данных, филогенетические деревья в котором организованы по принципу наибольшей/наименьшей схожести последовательностей нуклеотидов в цепочке.

Также напрямую можно произвести количественный учет живых и мертвых клеток методом флуоресцентной микроскопии.

При помощи молекулярных методов можно определить функциональные особенности организма и его роль в сообществе.

ПЦР – полимеразная цепная реакция.

(В 80-х годах 20 века осуществил Кэри Маллис) Процесс, позволяющий получать на выходе в больших количествах нужный участок ДНК (амплификация генов). Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов.

Применяется для:

1. Идентификации организмов

2. Поиска функциональных генов (н. nod-ген азотфиксации)

3. В медицине, криминалистике и прочих, временно не интересующих нас, областях )

Состав рекреационной смеси при ПЦР:

• ДНК-матрица

• 2 праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК

• Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), архей Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

• Смесь нуклеотидов

• Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы

• Буферный раствор с pH=8,8 и различные добавки (глицерин, формамид, катализаторы, активаторы полимеразы)

ПЦР осуществляется в несколько этапов:

1. Денатурация молекулы ДНК при 95 ‘С, несколько сек.

2. Отжиг праймеров (присоединение их к участку ДНК), при T 45-60’C, примерно 30 сек (все зависит от праймеров). На этом этапе случается большинство ошибок, важно правильно подобрать температуру.

3. Синтез цепи, при 72 ‘C. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

Цикл повторяется необходимое количество раз, в результате чего получаем достаточную концентрацию нужного участка ДНК.

Метод FISH – метод гибридизации in situ

Можно ответить на вопросы:

• Сколько клеток?

• Сколько физиологически активных?

• Сколько относится к филогенетической группе?

Этапы:

1. Десорбция клеток с твердой фазы – обработка ультразвуком

2. Осаждение твердой фазы – центрифугирование

3. Клеточная суспензия наносится на стекло с тефлоновым покрытием, обрабатывается гибридизационном буфером, на стекло наносится определенный зонд (чем-то окрашеный), затем применяется промывчный буфер, удаляющий негибридизированные зонды, при T приблизительно 46 ‘C, производится окраска (акритин оранжевый, DAPI)

4. Стекло исследуется под флуоресцентным микроскопом. Общие красители окрашивают всю молекулу ДНК, а зонды – РНК (есть только в живых клетках), производится подсчет.

Зонды также могут быть сконтруированы для определенного специфического участка хромосомы, что в некоторых случаях позволяет относить организмы к филогенетическим группам.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.

Возможности метода:

• Определение биологического разнообразия

• Подойдут самые различные субстраты

• Каждая «полоска» чаще всго определяет вид, если условия подобраны нечетко – то группу видов

Температурный гель-электрофорез

Принцип метода: денатурирующий агент (мочевина, формамид) расщепляет 2-ную ДНК -> плавление ДНК определяется наличием водородных связей. ГЦ пары связаны прочнее -> регионы с большим содержанием ГЦ-пар плавятся при более высоких T.

Этапы:

1. Амплификация с праймером GCclamp в 50 мл смеси.

2. Подготовка денатурирующего геля путем смешивания 2-х растворов акриламида с различными концентрациями денатурирующего агента.

3. Добавление геля в емкость, содержащую предварительно нагретый до 60 ‘C буфер и предварительная прогонка геля.

4. Добавление загрузочного буфера в образцы и дополнительного геля

5. Проведение электрофореза с установленным режимом напряжения и фиксированным временем

6. Покраска геля и анализ

Преимущества:

• Высокая производительность и чувствительность

• Участки геля с нужными результатами ПЦР могут быть в дальнейшем реамплифицированы и сквенированы

Недостатки:

• Дороговизна праймеров

• Анализ ПЦР-фрагментов длиннее 500 пар оснований представляет затруднение

• Гены, богатые ГЦ парами анализируются с существенными методическими трудностями

• Использование токсичных веществ (формамид, акриламид, этидиумбромид)

• Недостаточная воспроизводимость результатов

Представление результатов в виде дендрограммы или кластерного анализа.

Наиболее часто используемые гели:

1. Агарозный, 100-10000 пар нуклеотидов

2. Полиакриламидный – 10 – 1000 пар, для высокого разрешения коротких молекул

3. Пульсирующий, 10 000 - 10 млн пар.

Секвенирование

- определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК

Цели: определение последовательности в новом гене, кот. отвечает за как-н. функцию, создание базы данных для молекулярного клонирования.

Методы секвенирования:

• Метод Сэнгера – ферментативный дезоксинуклеотидный метод. Основан на присоединении к однонитчатой ДНК прямого или обратного праймера и синтезе молекулы нуклеиновой кислоты, с применением дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). При дидезокси-секвенировании происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель.

• Химический метод (метод Эдмана). Был разработан в 50-е. Обработка ДНК спец. хим. веществами

Компоненты:

• Одноцепочечная ДНК

• Праймер forward или reves

• ДНК-полимераза

• Буфер + Mg2+

• Дидезоксинуклеотидтрифосфат - блокировщик