Инструкция к практическому занятию: «Определение активности АлАт и АсАт»

Принцип метода. В результате работы аминотрансфераз образуются альфа-кетокислоты, которые в реакции с 2,4-ДНФГ (динитрофенилгидразином) образуют цветные соединения – гидразоны. Гидразон пировиноградной кислоты в щелочной среде имеет красно-бурое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству пировиноградной кислоты. По количеству пировиноградной кислоты судят об активности аминотрансфераз.

Материальное обеспечение: 0,1% раствор 2,4-ДНФГ; 0,4М раствор едкого натра, субстратно-буферные смеси для определения активности АсАТ и АлАТ, сыворотка крови, термостат, ФЭК, термометр, водяная баня, пипетки, пробирки, штативы.

Определение активности АсАт

1. Внесите в пробирку 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения активности АсАТ и добавьте в пробирку 0,1 мл сыворотки крови.

2. Поместите пробирку в термостат на 15 минут, температура 37 С.

3. Затем добавьте в пробирку 0,5 мл раствора 2,4 –динитрофенилгидразина.

4. Реакционную смесь необходимо выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре,

5. Далее добавьте в пробирку 5 мл 0,4М раствора едкого натра и оставьте раствор на 10 минут при комнатной температуре для стабилизации окраски.

6. Через 10 минут необходимо измерить оптическую плотность раствора на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 500 – 560 нм) в кювете толщиной 1 см.

Определение активности АлАт

1. Внесите в пробирку 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения активности АлАТ и добавьте в пробирку 0,1 мл сыворотки крови.

2. Поместите пробирку в термостат на 30 минут, температура 37 С.

3. Затем добавьте в пробирку 0,5 мл раствора 2,4 –динитрофенилгидразина.

4. Реакционную смесь необходимо выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре,

5. Далее добавьте в пробирку 5 мл 0,4М раствора едкого натра и оставьте раствор на 10 минут при комнатной температуре для стабилизации окраски.

6. Через 10 минут необходимо измерить оптическую плотность раствора на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 500 – 560 нм) в кювете толщиной 1 см.

Для определения активности обоих ферментов Вам необходимо построить калибровочные графики. При построении калибровочного графика на оси ординат необходимо отложить значения оптической плотности, а на оси абсцисс - содержание пировиноградной кислоты (ПВК) в калибровочных пробах (в мкмолях). Активность ферментов в данных условиях исследования (в мкмолях ПВК, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки за 1 час), рассчитывается по формулам:

Х=10 х С (для АсАТ) и Х=10 х 2 х С (для АлАТ), где:

С- количество ПВК по калибровочному графику (в мкмолях);

10-коэффициент перерасчета на 1 мл сыворотки;

2- коэффициент перерасчета на 1 час инкубации.

Лабораторные нормы: для АсАТ - 0,1- 0,5 мкмолей ПВК на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации, для АлАТ - 0,1-0,7 мкмолей ПВК на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации.

Калибровочные графики зависимости оптической плотности растворов ПВК от содержания ПВК:

а) для определения активности АсАТ:

б) для определения активности АлАТ:

ВЫВОДЫ:

Подпись преподавателя:

Приложение 1