8.6. Стадии роста периодической бактериальной культуры
При выращивании бактерий в жидкой питательной среде можно постоянно отбирать выросшую бактериальную массу, удалять продукты метаболизма бактерий и добавлять новую полноценную питательную среду. Т.е. постоянно поддерживать оптимальные условия культивирования. В этом случае культура будет постоянно расти с максимальной скоростью. Такая культура называется хемостатной, потому что для ее получения используют специальные приборы - хемостаты, – которые и дают возможность совершать вышеописанные манипуляции. Такие культуры используются в промышленной микробиологии для получения полезных веществ – продуктов микробного метаболизма (антибиотиков, аминокислот и т.д.). Если же бактериальная культура выращивается в пробирке (именно такой способ используется в медицинской микробиологии), то с течением времени в питательной среде накапливаются продукты бактериального метаболизма, а питательная среда, наоборот, истощается. В результате, чтобы культура не погибла, ее необходимо периодически пересевать на свежую питательную среду. Такая культура называется периодической. В своем росте она проходит девять стадий (фаз) развития.
А. После внесения в питательную среду инокулята (посевной дозы), наступает лаг-фаза (Рис. 8-6). Деление клеток на этой стадии не происходит – бактерии как бы приспосабливаются к новой среде обитания; при этом некоторое количество их может погибнуть.
Б. Затем наступает фаза положительного ускорения (Рис. 8-7). Бактериальные клетки начинают делиться и скорость их деления постоянно увеличивается.
В. Наконец, скорость деления клеток достигнет максимального значения и останется таковой некоторое время (Рис. 8-8). Это экспоненциальная фаза (фаза логарифмического роста).
Г. Однако, со временем количество питательных веществ в среде снижается, а концентрация продуктов метаболизма бактериальных клеток увеличивается. В результате условия для размножения и роста бактерий ухудшаются, и скорость деления бактериальных клеток снижается – наступает фаза отрицательного ускорения (Рис. 8-9). Однако, на этой стадии количество живых бактериальных клеток в культуре все еще увеличивается, правда с постоянно снижающейся скоростью.
Д. Стадия, во время которой в каждый конкретный момент времени количество вновь появившихся живых бактериальных клеток равно количеству погибших, называется стационарной фазой максимума (Рис. 8-10). Бактериальная культура, достигшая в этой фазе роста максимально возможной при данных условиях культивирования концентрации живых бактериальных клеток, называют остановившейся.
Е. Затем количество живых бактериальных клеток начинает уменьшаться с увеличивающейся скоростью. Эта стадия роста бактериальной культуры называется фазой ускоренной гибели (Рис. 8-11).
Ж. Стадия, во время которой эта скорость убывания живых бактериальных клеток становится максимальной, называется фазой логарифмической гибели (Рис. 8-12).
З. Со временем, однако, эта скорость начинает уменьшаться – наступает фаза уменьшения скорости гибели (Рис. 8-13).
И. В конце концов культура некоторое время будет состоять из минимального количества живых бактериальных клеток. Эта стадия роста бактериальной культуры называется стационарной фазой минимума (Рис. 8-14). Время, которое бактериальная культура сможет продержаться до своей гибели на этот минимуме, зависит как от вида микроорганизмов, так и от условий культивирования.
Рис. 8-14. Стадии роста периодической бактериальной культуры: стационарная фаза минимума |
8.7. Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий
В зависимости от способа создания безвоздушной среды, все методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делят на физические, химические и биологические. Особняком стоит метод Китта-Тароцци, сочетающий в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов.
А. Воздух, точнее кислород воздуха, можно удалить из среды культивирования бактерий физическими методами.
1. Можно использовать анаэростат – сосуд с герметической крышкой, из которого отсасывают воздух насосом. В такой сосуд помещают чашки Петри с посевами и после откачивания воздуха ставят (если он по своим размерам позволяет это сделать – такие небольшие анаэростаты называются микроанаэростатами) в термостат, где происходит культивирование бактерий.
2. Существуют, по сути, разновидности анаэростатов, в которых удаленный воздух замещается каким-нибудь инертным газом, например – в аппарате Кипа – водородом.
3. Один из наиболее распространенных способов создания анаэробных условий при культивировании бактерий используется в так называемых трубках Виньяль-Вийона. Этот метод прост в осуществлении и не требует какой-либо особой аппаратуры. В трубках Виньяль-Вийона осуществляется глубинное культивирование бактерий. Для этого бактериальная культура разводится в расплавленной и охлажденной питательной среде (в пробирках или пипетках – отсюда и название «трубки») с таким расчетом, чтобы бактериальные клетки находились на значительном удалении одна от другой. При застывании питательной среды бактериальные клетки оказываются «замурованными» в ее толще и при культивировании каждая из них формирует отдельную колонию (естественно, без доступа кислорода воздуха).
4. Анаэробные условия для культивирования бактерии создадются и в случае их засева уколом в высокий столбик полужидкого агара. Место укола тут же затягивается и бактерии растут в толще питательной среды.
5. Удалить воздух, растворенный в жидкой питательной среде, можно с помощью кипячения. При нагревании жидкости растворенный в ней воздух выходит в атмосферу, что мы и наблюдаем в виде «бурления». Такой процесс называется регенерацией питательной среды. Чтобы впоследствии при медленном охлаждении воздух вновь не растворился в питательном бульоне, его охлаждают очень быстро (например, под струей холодной воды).
6. Чтобы свести к минимуму диффузию атмосферного воздуха в питательную среду, ее поверхность покрывают слоем жидкого масла (например, вазелинового). В этом случае говорят о «культивировании под слоем масла».
7. При глубинном культивировании бывает трудно получить доступ к нужной колонии и извлечь ее из толщи питательной среды. Облегчает эту задачу метод Перетца: в чашку Петри заливается расплавленная и охлажденная питательная агаризованная среда, смешанная с бактериальной культурой, на поверхность которой осторожно помещается предметное стекло, которое слегка вдавливают в питательный агар. Те колонии, которые вырастают непосредственно под этим стеклом, после снятия последнего становятся легко доступными.
Б. Химические методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делятся на две группы.
1. Для связывания кислорода воздуха можно провести в замкнутом объеме (например, в эксикаторе с притертой крышкой) химическую реакцию, которая протекает с поглощением воздуха.
а. В методе Аристовского с этой целью используются сыпучие ингредиенты. В развитие этого метода современная микробиологическая промышленность выпускает специальные наборы, с помощью которых можно создать газовую смесь, как с полным отсутствием кислорода, так и с присутствием его, а также углекислого газа и азота, в определенных концентрациях, необходимых для культивирования бактерий с «нестандартными» требованиями к условиям аэрации.
б. В методе Омелянского с этой целью используются жидкие ингредиенты (пирогаллол и едкое кали).
2. Можно добавить в жидкую питательную среду вещества, связывающие кислород. Такие вещества называются редуцирующими. К ним относится, например, глюкоза, тиогликолевая кислота и ряд других.
В. В качестве биологического метода создания анаэробных условий для культивирования бактерий наиболее распространен (в различных модификациях) метод Фортнера. Принцип его состоит в том, что в замкнутом объеме (например, в парафинированной чашке Петри) одновременно культивируются анаэробы и так называемый «жадный аэроб» – вид бактерий, усиленно поглощающий при своем росте кислород. В качестве последнего наиболее часто используется энтеробактерия Serracia marcescens. Аэроб уничтожает весь кислород замкнутого объема, создавая тем самым условия для роста анаэроба.
Г. Метод Китта-Тароцци заключается в использовании для культивирования анаэробов одноименной питательной среды. Среда Китта-Тароцци состоит из мясопептонного бульона, содержащего глюкозу (в качестве редуцирующего вещества), регенерированного и залитого слоем масла, на дно пробирки помещают кусочки паренхиматозного органа (чаще – печени) для адсорбции растворенного в мясопептонном бульоне воздуха.