Метод Лоури
Метод Лоури — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Лоури (Lowry) в 1951 году.
Принцип. В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота сфенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку - 10 - 100 мкг/мл.
Спектрофотометрические методы
Спектрофотометрические методы. Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами ферментов, субстратами или продуктами реакции. Положение максимума поглощения при определенной длине волны определяется наличием в исследуемом материале определенных групп - аналитических форм. Для измерения спектров используют специальные приборы - спектрофотометры, фотометрические абсорбциометры и др. Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием фермента и реактивов и позволяет следить за течением реакции во времени. Для этого реакционную смесь помещают в кювету, вставленную в термостатируемый кюветодержатель. Через малый промежуток времени после добавления фермента (или субстрата) и быстрого перемешивания измеряют поглощение при длине волны, характерной для используемого субстрата или конечного продукта, образующегося в данной реакции. С помощью спектрофотометрического метода можно измерять непосредственно концентрацию некоторых ферментов (после достаточной очистки) по величине характерных максимумов поглощения прочно связанных коферментов (простетических групп). Необходимо иметь произвольно выбранную единицу фермента, с помощью которой можно было бы количественно выразить чистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицы зависит от избираемого метода определения. В случае спектрофотометрического метода такой единицей может служить количество фермента, которое вызывает определенное изменение в оптической плотности за определенное время при данных условиях опыта; если определяется продукт реакции, то единицей будет количество фермента, которое вызывает образование определенного количества вещества в минуту, и т.д. Тогда удельную активность фермента, которая является мерилом чистоты ферментного препарата, выражают числом единиц в 1 мг вещества (белка).
Для целей определения ферментов могут быть использованы не только измерение поглощения света, но также измерения флюоресценции - спектрофлюорометрические методы. Такое определение активности фермента в ряде случаев по чувствительности превосходит спектрофотометрические методы на целый порядок величины. Некоторые коферменты и субстраты обладают сильной флюоресценцией. НАД и НАДФ в восстановленном состоянии имеют сильную флюоресценцию и не флюоресцируют в окисленном состоянии. Поэтому спектрофлюорометрию используют для изучения кинетики и механизма действия никотинамидных и флавиновых ферментов.
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Электрофорез белков сыворотки крови на бумаге
Электрофоретические исследования. В клинической практике применяется зональный электрофорез для исследования белкового состава жидкостей организма. Чаще используют электрофорез на бумаге как наиболее простой по технике выполнения. Электрофорез в агаровом и крахмальном гелях используется в медицинской практике преимущественно в научных исследованиях.
При помощи электрофореза на бумаге разделяют в крови фракции белков, липопротеидов, глюкопротеидов, а также белковые фракции мочи, желудочного сока, экссудатов и т. и. В крови электрофорез выявляет 5 основных фракций белка: альбумины, альфа-1 (α1) альфа-2(α2)-, бета(β)- и гамма(γ)-глобулины. В норме их соотношение более или менее постоянно. При некоторых заболеваниях эти соотношения меняются, что может иметь диагностическое и прогностическое значение. Так, например, при острых воспалительных процессах увеличивается содержание в крови α2-глобулинов; в период выработки иммунитета нарастает содержание γ-глобулинов; при поражениях печени снижается содержание альбуминов и т. и. При некоторых заболеваниях (например, при миеломной болезни) в плазме крови появляются патологические белки (парапротеины), которые могут быть выявлены с помощью методов электрофореза, что имеет большое диагностическое значение.
Суть метода. Электрофорез на носителях (зональный электрофорез). В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов и др. В клинических лабораториях особо широкое распространение для исследования сыворотки крови получил электрофорез на бумаге, который проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором (см.), наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускания постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен — о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.
В последнее время широкое применение в исследовательской работе и в клинической диагностике находит электрофорез в тонких слоях гелей, нанесенных на стеклянные пластинки (дисковый электрофорез), а также помещенных в стеклянные трубочки.