Количественное определение белка в биологическом материале

Как при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержания белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце. Кроме того, анализ содержания белков в биологических жидкостях (крови) имеет важное биомедицинское значение и используется в диагностических целях. Количественное определение белка проводится, как правило, с небольшим количеством материала и требует высокочувствительных методов детекции. Наиболее широко распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определения белка.

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД К колориметрическим методам определения количества белка используется:

• Биуретовый метод

• Микробиуретовый метод

• Метод Бредфорда

• Метод Лоури

Биуретовый метод

Биуретовый метод – один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Разработан в 1949 году Горналлом, Бардавиллом и Дэвидом, ныне мало используется в биохимической лабораторной практике (за исключением медицинских анализов на белок) из-за низкой чувствительности.

Принцип метода. Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO₄ и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют при 540—560 нм.

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

Чувствительность данного метода позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.

Микробиуретовый метод

Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса, образующегося в результате взаимодействия пептидных связей с Cu2+ в щелочной среде. К 0,2 мл ПМ лимфоцитов, сыворотки или плазмы добавляли 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Выдерживали 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрировали на СФ — 46 при 330 нм. Построение калибровочного графика проводили по стандартному раствору белка.

Метод Бредфорда

Метод Бредфорда — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Мерионом Бредфордом (англ. en:Marion M. Bradford) в 1976 году. Статья М. Бредфорд в журнале Anal Biochem, посвящённая методу количественного определения белка в растворе, является одной из самых цитируемых научных статьей в мире. Метод основан на реакции красителя кумасси (coomassie) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе.

Метод даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения адсорбции от концентрации, в целом чувствительность метода зависит от соотношения концентраций определяемого белка и красителя: чем больше красителя, тем чувствительней метод), менее "капризный" по сравнению с методом Лоури.