1.8. Гибридные методы

Хромато-масс-спектроскопия (ХМС) - гибридный метод анализа, сочетающий капиллярную газовую хроматографию и масс-спектрометрию.

Масс-спектрометры используются в качестве детекторов в газовой хроматографии уже около 30 лет. За это время повысилось качество масс-спектрометров и появилась возможность получать надежные и воспроизводимые аналитические данные. При этом стоимость выпускаемых серийно масс-спектрометров существенно уменьшилась.

Современный хромато-масс-спектрометр позволяет проводить анализ сложной смеси из нескольких десятков компонентов в течение 30 мин. За такое короткое время химик-аналитик получает полную количественную и качественную информацию об анализируемой смеси. ХМС позволяет охарактеризовать полученный в результате анализа газохроматографический пик соответствующим масс-спектром, который затем может быть сопоставлен с масс-спектром из библиотеки спектров, хранящихся в базе данных. Система обработки данных позволяет сравнить стандартный спектр известного соединения с неизвестным спектром. В качестве дополнительной информации о структуре выдаются данные о коэффициенте корреляции между библиотечным спектром и спектром анализируемого соединения.

Возможности ХМС обусловлены сочетанием разделительной способности капиллярной газовой хроматографии, идентификации анализируемых соединений по специфичным масс-спектрам и количественной оценки по площадям пиков. По сравнению с другими детекторами масс-спектрометр более универсален и позволяет детектировать любые органические соединения с высокой чувствительностью.

Масс-спектрометрия это метод анализа вещества путем определения отношения массы к заряду m/z и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, называется масс-спектром вещества.

На рис. 16 представлен масс-спектр ацетона, полученный при ионизации электронным ударом. В масс-спектре имеются три основных полосы, соответствующие образованию молекулярного иона (m/z=58), основным пиком (m/z=43) и пиком метильной группы (m/z=15).

Рис. 16. Масс-спектр ацетона, полученный путем ионизации электронным ударом, с пиком молекулярного иона (m/z 58), основным пиком (m/z 43) и пиком метильной группы (m/z 15).

Для разделения ионов исследуемого вещества по величине m/z, измерения этих величин и токов разделенных ионов используют масс-спектрометр, который состоит из 5 основных частей: 1) устройства ввода пробы, выходящей из разделительной колонки хроматографа; 2) ионного источника: 3) анализатора масс; 4) детектора: 5) системы управления и обработки данных (рис. 17). 2 - 4 блоки прибора находятся под глубоким вакуумом.

Вакуум в газохроматографической колонке не создается, поэтому стыковка газового хроматографа с масс-спектрометром представляет собой сложную задачу из-за различия давлений, которые требуются для успешного функционирования каждого из приборов. Было разработано несколько устройств для ввода пробы, позволяющих переходить от высокого давления на выходе из хроматографической колонки к низкому давлению масс-спектрометра и обеспечивающих минимальные потери анализируемых веществ.

Рис. 17. Схема массспектрометра с ионным источником электронного удара, квадрупольным анализатором масс, электронным умножителем непрерывного динодного типа

В качестве ГХ - МС интерфейсов использовали главным образом 1) мембраны из силиконовой резины, 2) эффузионные трубки и 3) молекулярный струйный сепаратор. В настоящее время чаще всего используется струйный сепаратор, принцип действия которого основан на законе сохранения количества движения. В сепараторе молекулы гелия отделяются от более тяжелых молекул анализируемой смеси (рис. 18). Выходное отверстие сопла имеет очень маленький диаметр, поэтому скорость газового потока, выходящего из колонки ГХ, близка к сверхзвуковой. Анализируемое вещество, обладающее большим количеством движения, проходит расстояние между двумя соплами, а наиболее легкие молекулы гелия отклоняются от прямолинейного движения и откачиваются насосом.

Струйные сепараторы успешно используются для стыковки насадочных и капиллярных кварцевых колонок большого диаметра ( 0,5 мм) с масс-спектрометром. Капиллярные колонки меньшего диаметра имеют низкую объемную скорость газового потока, что упрощает ее стыковку с масс-спектрометром.

Рис. 18. Схема молекулярного струйного сепаратора:   молекулы сорбата,   гелий	Рис. 19. Схема открытого ввода с делителем потока для подсоединения капиллярных колонок к масс-спектрометрам.

В настоящее время кварцевые колонки подсоединяют к масс-спектрометру либо напрямую, либо посредством открытого ввода с делителем потока. Непосредственное подсоединение капиллярной колонки к ионному источнику это простейший вариант стыковки ГХ  МС, который используется для капиллярных колонок с диаметром, не превышающим 0,2 мм. Применение колонок с большим диаметром требует высокопроизводительных систем создания вакуума.

При использовании открытого ввода с делителем потока в масс спектрометр попадает только определенная часть потока. Вакуум в газохроматографической колонке не создается, и ее разрешающая способность остается неизменной. Это устройство было разработано специально для колонок с диаметром не превышающим 0,35 мм. На рис. 19 представлена схема открытого ввода с делением потока и показаны направления газовых потоков. Дополнительный поток газа-носителя проходит коаксиально выходу из колонки и создает гидравлическое соединение. Поток газа на продувку способствует тому, что вспомогательный газ компенсирует любые отклонения в потоке, выходящем из колонки.

	Для получения ионов в масс-спектро-метрах наиболее часто используются ионизация посредством электронного удара, схема которого представлена на рис. 20. Современные библиотеки масс-спектров содержат более 120000 спектров, полученных с ионизацией электронным ударом. Самой обширной библиотекой данных является коллекция масс-спектров EPA/NIH, которая используется для
Рис. 20. Схема ионного источника электронного удара.	сопоставления и идентификации спектров при анализе лекарственных средств и объектов окружающей среды.

Для разделения ионов, образовавшихся в ионизаторе, используются анализаторы масс пяти основных типов: 1) магнитные, 2) электростатические, 3) времяпролетные, 4) ионно-циклотронного резонанса и 5) квадрупольные. Наибольшее распространение получили магнитные и квадрупольные анализаторы. С помощью именно этих анализаторов получена большая часть масс-спектров, составляющих библиотеки.

Разделение ионов по массам в наиболее популярном квадрупольном анализаторе осуществляется за счет различного поведения ионов в поле постоянного и высокочастотного тока (рис. 21). Масс-спектр получают при прохождении иона через поле и регистрации тока ионов при попадании детектор.

Рис. 21. Схема квадрупольного масс-анализатора: 1  высокочастотный генератор; 2  генератор постоянного напряжения; 3  генератор развертки; 4 и 5  источник и детектор ионов.

Квадрупольный масс-анализатор представляет собой квадрупольный конденсатор, к парам параллельных стержней которого приложены постоянное напряжение V и переменное высокочастотное V_0cost ( - частота, t - время); их суммы для каждой пары равны по величине и противоположны по знаку. Ионы, вылетевшие из ионного источника, движутся к камере анализатора вдоль оси z, параллельной продольным осям стержней, по сложным спиралевидным траекториям, совершая поперечные колебания вдоль осей x и y. При фиксированных значениях частоты и амплитуды переменного напряжения ионы с определенными значениями m/z проходят через квадрупольный конденсатор и попадают в детектор, у ионов с др. значениями m/z амплитуда поперечных колебаний достигает такой величины, что они ударяются о стержни и разряжаются на них. Развертка масс-спектра производится путем изменения постоянного и переменного напряжений или частоты.

В масс-спектрометрах наибольшее распространение в качестве детекторов получили электронные умножители дискретного динодного и непрерывного динодного типов. Оба этих устройства обеспечивают высокие значения усиления (10⁷), что позволяет детектировать чрезвычайно малые ионизационные токи (порядка фемтоампер). Возможность детектирования малых токов определяет очень высокую чувствительность масс-спектрометров как детекторов для ГХ. Большинство квадрупольных масс-спектрометров обеспечивает детектирование пиктограммовых (10^-12) количеств летучих веществ.

Возможность получать с помощью ХМС количественную информацию об анализируемом объекте достигается двумя путями, Во-первых, можно определить сумму всех сигналов ионного тока и получить зависимость ионного тока от времени. Во-вторых, можно выделить любой ионный ток для выбранного фрагмента и получить дополнительные зависимости. Эти зависимости называют соответственно общим ионным током и профилем тока выбранного иона. На практике чаще используют сигнал общего ионного тока. Полученные сигналы могут быть обработаны как ГХ-сигналы, имеющие определенные времена удерживания и интегральные площади. Так же, как и в ГХ, можно по измеренным площадям сигналов количественно охарактеризовать исследуемый объект с высокой степенью точности и воспроизводимости. На рис. 22. В качестве примера приведены профиль общего ионного тока для стандартной лекарственной смеси и выделенные ионные профили молекулярных ионов каждого соединения.

Рис. 22. Профиль общего ионного тока для стандартной лекарственной смеси кофеина, метадона, кокаина, кодеина, моноацетилморфина и героина и выделенные ионные профили молекулярных ионов каждого соединения.

Возможности применения ХМС для анализа органических веществ практически неограниченны. Этот метод с одинаковым успехом используется как в исследовательских работах, так и при проведении рутинных определений качества веществ и контроля содержания токсичных веществ в объектах окружающей среды. При этом продолжительность анализа составляет всего несколько минут, что делает хромато-масс-спектроскопию на сегодняшний день наиболее эффективным аналитическим методом.

Кроме ХМС в исследовательской практике используется также сочетание высокоэффективной газовой хроматографии с инфракрасной (ИК) спектроскопией, которое представляет собой мощное для получения специфической информации о молекулах анализируемых веществ. Под действием ИК-излучения возбуждаются деформационные и валентные колебания молекул вещества. Эти колебания являются характеристическими для функциональных групп анализируемой молекулы. Проводя интерпретацию спектров вручную или используя библиотеки спектров, можно идентифицировать хроматографируемые соединения по их ИК-спектрам.

Приборы для ИК-спектроскопии выпускаются промышленностью уже более 50 лет. В первых ИК-спектроскопах использовалось светорассеивание, а для разделения ИК-излучения на узкие полосы в них применяли призмы или дифракционные решетки. Затем последовательно облучали анализируемый образец полученными узкими полосами. Такой способ позволял осуществлять сравнительно медленное механическое сканирование. В современных ИК-спектрометрах с преобразованием Фурье вместо призмы или решетки использется интерферометр. В результате практически мгновенно происходит сканирование по всему ИК-диапазону. Это дало возможность подключать ИК-спектрометры непосредственно к капиллярным газовым хроматографам.

ИК-спектроскоп незаменим при идентификации соединений, имеющих сходное строение. Сочетание ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии позволяет получить об анализируемом соединении дополняющие друг друга сведения и провести качественный анализ с высокой степенью надежности. Это можно продемонстрировать на примере определения амфетамина и метамфетамина. Масс-спектры этих веществ практически одинаковы, однако ИК-спектры сильно отличаются.

Следует отметить сходство хроматограмм общего сигнала, полученных при ИК-детектировании, и хроматограмм общего ионного тока при МС-детектировании.

В заключение необходимо остановиться на различиях в терминах “гибридная хроматография” и “многомерная хроматография”. Иногда гибридные методы, такие как ГХ-МС и ГХ-ИК, относят к многомерным методам, даже если разделение проводится с помощью одной колонки. В этих методах используется многомерное детектирование, т.е. они многомерны с точки зрения получаемой информации. Однако их не следует считать многомерными с точки зрения хроматографирования, если оно осуществляется с помощью одной колонки.

В многомерной газовой хроматографии (МГХ) для проведения разделения, которое невозможно осуществить с помощью одной колонки, используют две или несколько соединенных колонок. Многомерная хроматография  это процесс, в котором проба проходит последовательно несколько стадий разделения. На каждой из них происходит разделение всей пробы или ее части, поступившей с предыдущей стадии, а используемые колонки различаются по селективности и (или) емкости.

Применение МГХ позволяет оптимизировать избирательность системы, при этом за минимальное время удается достичь максимального разделения компонентов пробы, содержащихся в ней в различных количествах.