6. Экспериментальное оборудование, материалы и расчёты.

Экстинкция суспензии эритроцитов измеряется на фотоколориметре (приборе, измеряющем оптическую плотность на различных длинах волн). Используемый в лабораторной работе колориметр КФК-2 позволяет проделывать это на 9 длинах волн от 315 до 750 нм. Тем самым можно, хотя и грубо, но построить кривую спектра пропускания исследуемых жидких препаратов. Величина пропускания Т определяется отношением прошедшего через образец потока излучения I к падающему потоку I₀ , приведенными к одному и тому же поперечному сечению:

(2)

Для корректности определения Т оптическая схема колориметра содержит коллиматор и диафрагмы, обеспечивающие квазипараллельность проходящего через образец пучка излучения. Поскольку как спектральная интенсивность источника, так и спектральная чувствительность приемника зависят от длины волны, в приборе используется калибровочный канал, в который помещается кювета, заполненная растворителем (в данном случае, физраствором, оптическая плотность которого в рассматриваемом интервале длин волн мало отличается от водяной). Измерение Т на каждой длине волны производится в 2 приема: сначала в луч вводится калибровочная кювета, и с помощью регулировки чувствительности приемного канала показания прибора устанавливаются на Т = 1 (шкала отградуирована в процентах). После этого прибор переключается на измерительный канал (калибровочная кювета выводится из луча и точно на ее место помещается измерительная кювета с испытуемой жидкостью). При правильной калибровке (100% пропускания при открытом окне фотоприемника и 0% при закрытом) показания прибора дают величину искомого пропускания. Против шкалы пропускания (равномерная от 0 до 100%) нанесена шкала оптических плотностей Д (логарифмическая) в соответствии с формулой

Д =  lg T (3)

Величина Д меняется в пределах от 0 (Т = 1) до  (Т = 0), однако фактическая возможность измерения Д определяется ценой деления шкалы. Так, при Т =0,1 Д = 1; при Т = 0,01 Д = 2; производить измерения с точностью, превы-

р

ис. 7. Геометрия эритроцита в различных условиях: а) в изотоническом растворе, б) при осмотическом давлении 217 мОсм/л, в) при осмотическом давлении 130 мОсм/л.

шающей 1% по Т, нереально, причем при малых пропусканиях (Т  10%) ошибка резко возрастает. Поэтому реальным диапазоном измерения Д является 0  Д  2. По этой причине фактическая возможность абсолютного измерения концентрации исследуемого вещества по оптической плотности, в соответствии с формулой Ламберта-Бера

Д = сL (4)

где с – концентрация,  - коэффициент молярной экстинкции, L – толщина образца (длина оптического пути излучения в испытуемой среде), затруднена. Однако относительная концентрация выживших частиц в зависимости от времени облучения t и дозы облучения D, имеющей смысл суммарной падающей на исследуемый пул клеток энергии излучения, может быть найдена на основе предложенной в МГУ им. М.В. Ломоносова [3] и развитой в МГТУ им. Н.Э. Баумана математической модели (см. приложение 1). Простейший вариант этой модели основан на предположениях о пренебрежении репаративными процессами, преобладании химического механизма тушения, отсутствии кислородного голодания и определении доли выживших клеток сразу после прекращения облучения. Результатом расчета при таких предположениях будет следующая зависимость относительной концентрации от дозы:

(5)

Здесь обозначено  t = D – доза воздействующего излучения, - постоянная, характеризующая скорость гибели сенсибилизированных клеток в начальный момент облучения. Найденная зависимость (5), будучи построенной в координатах ( ), и называется дозовой кривой. Коэффициент характеризует крутизну этой кривой (см. приложение 1). В виде дозовой кривой можно представить и экспериментальные данные. Пример дозовой кривой приведён на рис. 9. Поскольку в дозовую кривую (5), определяющую зависимость ln от дозы облучения, входит не абсолютная концентрация сенсибилизированных частиц, а относительная, приводить в соответствие измеряемую оптическую плотность Д с абсолютной молярной концентрацией с нет необходимости, тем более, что коэффициент молярной экстинкции  априори неизвестен.

Рис.8. Схема экспериментальная установки для наблюдения ФДЭ на взвеси эритроцитов: 1 – источник света, 2 – конденсор, 3.6.8 – диафрагмы; 4 – коллиматор; 5 – сменные интерференционные фильтры; 7 – кювета с исследуемой жидкостью; 9 – светоделительная пластинка; 10 – фотодиод; 11 – фотоэлемент; 12 – усилитель постоянного тока; 13 – измерительный прибор.

Рис.9. Расчётные дозовые кривые в предположении о преобладании химического механизма тушения.

Правильное построение дозовых кривых для ФДЭ должно содержать: а) выбор концентрации эритроцитов в суспензии в соответствии с исходным пропусканием образца в пределах Т = 2030%, чтобы диапазон изменения пропускания при гемолизе эритроцитов был велик по сравнению с исходной величиной пропускания; б) выбор концентрации ФС, достаточно большой для обеспечения полного поражения всех эритроцитов в образце, но при этом достаточно малой для того, чтобы исходное пропускание образца с добавленным ФС не сильно отличалось от несенсибилизированного (т.е. находилось в пределах тех же 2030%); в) обязательное измерение характеристик контрольного образца, выдерживаемого параллельно с облучаемым в темноте, с тем, чтобы выделять при каждом измерении ту оптическую плотность, которая определяется именно ФДЭ, а не всеми прочими причинами. Основной серии измерений, позволяющих построить дозовую кривую, должны предшествовать 2 серии предварительных измерений: а) спектральной характеристики пропускания суспензии эритроцитов (несенсибилизированной); б) спектральной характеристики пропускания раствора ФС. Эти кривые позволяют определить как предпочтительную длину волны источника засветки, так и длину волны, на которой следует вести измерения Т и Д для наиболее заметного проявления ФДЭ. Очевидно, что первая должна быть близка к максимуму поглощения ФС, вторая – к максимуму экстинкции суспензии эритроцитов. Доза облучения (в относительных единицах) определяется посредством измерения времени облучения. В качестве контрольного, как в начале, так и по окончании опыта, следует провести измерение плотности потока излучения (освещенности), даваемой используемым источником. Это необходимо для того, чтобы можно было считать зависимость дозы D облучения от времени t линейной (обеспечение линейности, согласно формулам (13) и (5), имеет место только при I₀ = const).