8.4 Визначення розчинного білка за Лоурі та спектрофотометричний методом

Загальні положення

Метод Лоурі широко використовується для визначення вмісту білка в розчині. Він базується на двох реакціях, які приводять до утворення стійкого забарвлення: утворення біуретового комплексу при дії на білок міді в лужному розчині; відновлення фосфомолібденового, фосфовольфрамового реагента білками, що обробляють лужною міддю.

Інтенсивність забарвлення, що виникає, вимірюють фотоколориметрично.

Хід роботи

До 2 мл досліджуваного розчину білка додають 4 мл реактиву С Суміш енергійно перемішують і через 10 хв додають 0,2 мл реактиву Е. Знову перемішують і пробірку залишають при кімнатній температурі на 30 хв. Інтенсивність синього забарвлення вимірюють на спектрофотометрі СФ-4 при довжині хвилі 750 мкм або на ФЕК-М з червоним світлофільтром.

Концентрацію білка в пробі визначають за отриманим значенням оптичної густини за допомогою калібрувальної кривої, яку будують на основі ряду точно приготовлених білкових розчинів нисхідної концентрації. Для побудови калібрувальної кривої слід брати кристалічний препарат чистого білка, що не має відношення до білка, який вивчаємо.

Спектрофотометричне визначення білків у розчині грунтується на їх здатності поглинати ультрафіолетове проміння відповідної довжини хвилі. Більшість білків мають максимум поглинання від 275 до 280 мкм, а в середньому 278 мкм.

Поглинання ультрафіолетових променів розчинами білків пояснюється присутністю в білку триптофану, тирозину та меншою мірою фенолфталеїну. На максимуми поглинання впливає рН середовища. Взагалі спектрометричні вимірювання проводять у лужних розчинах.

Екстинція нуклеїнової кислоти 280 мкм може в 10 раз переви­щувати екстинцію білка при тій самій довжині хвилі. Тому домішок невеликої кількості нуклеїнової кислоти може мати великий вплив на поглинання.

Варбург та Кристіан визначили поглинання сумішей нуклеїнової кислоти та білка при 260 і 280 мкм і запропонували таб­лицю, по якій можна визначити кількість білка в невідомому розчині за даними електрофотометричного вимірювання при двох вказаних довжинах хвиль.

Для того щоб не користуватися таблицями та графіками, Калькар вивів формулу для визначення вмісту білка:

Білок мг/мл = 1,45Е280 - 0,74Е260.

Слід враховувати, що визначення концентрацій білка в розчині спектрофотометричним методом у кілька раз менш точне, ніж за методом Лоурі. Проте в багатьох випадках, особливо під час реєстрації результатів фракціонування білків на колонках, коли треба визначити в багатьох фракціях, ця методика незамінна.

У розчинах білка, в яких визначався білок за методом Лоурі, на спектрофотометрі вимірюють екстинцію при двох довжинах хвиль: Е280 та Е2б0.

На основі отриманих даних враховують концентрацію білка в мг на мл за формулою Калькара.

Реактиви

1. 0,1 н розчин їдкого натру.

Реактив А (2 % -й розчин вуглекислого натру в ОД н розчині "їдкого натру).

Реактив В (0,5 %-й розчин сірчанокислої міді в 1 % -му роз­чині виннокислого натрію або калію. Розчиняють 10 г виннокислого натрію або калію в 300 мл дистильованої води, в отриманий розчин вносять 5 г сірчанокислої міді і після її розчинення об'єм доводять дистильованою водою до 1 л).

4. Реактив С (перед анаяізом 49 мл реактиву А змішують з 1 мл реактиву Б).

Вольфрамовокислий натрій х.ч. Ыя2Ш04 4 2Н20.

Молібденовокислий натрій х.ч. Ма2Н04 * 2Н20.

Ортофосфорна кислота,

Концентрована соляна кислота.

Сірчанокислий літій.

Реактив Фоліна (в круглодонну колбу на 1,5...2 л вносять 100 г вольфрамовокислого натрію і 25 г молібденовогокислого натрію і розчиняють їх у 700 мл дистильованої води. До розчину додають 50 мл 85 % -ї фосфорної кислоти і 100 мл концентрованої соляної кислоти. До колби приєднують зворотний холодильник і суміш кип'ятять на сітці протягом 10 год, після чого в колбу вносять 150 г сірчанокисло­го літію, додають 50 мл дистильованої води і 5 крапель бромної води. Суміш кип'ятять без холодильника 15 хв під тягою. Потім розчин охолоджують до кімнатної температури, доводять об'єм водою до 1 л, фільтрують і зберігають у темній склянці з притертою пробкою. По­трібно визначати кислотність отриманого розчину. Для цього реак­тив розбавляють в 10 раз і титрують 0,1 н розчином їдкого натру по фенолфталеїну).

Реактив Е (готують з реактивом Фоліна, розбавляючи його дистильованою водою так, щоб кислотність готового розчину була 1 н. Якщо при титруванні реактиву Фоліна виявилось, що його лужність становить 2,3 н, для приготування реактиву Е потрібно взяти 10 мл реактиву Фоліна і 13 мл дистильованої води. Реактив Е можно збері­гати тривалий час).

12. Препарат електрофоретично чистого білка.

Контрольні питання

1. Структура рибосом, їх роль у синтезі білка.

2. Стадії синтезу поліпептидного ланцюга: активація; ініціація; елонгація; термінація.

3. Організація різних типів РНК.

4. Механізм реплікації ДНК.

5. Характеристика ферментів, що беруть участь у біосинтезі білка.

6. Принцип методу визначення білків за вмістом загального та білкового азоту.

7. Принцип методу визначення розчинного білка за Лоурі та спектрофотометричним методом.