5.3. Визначення аміногрупи за реакцією з нінгідрином (метод Лі та Такахамі)

Метод базується на кількісному визначенні аміногруп за реакцією з нінгідрином .

З досліджуваним розчином проводять реакцію з нінгідрином у присутності гліцерину, визначають оптичну густину фотоколориметрично та концентрацію амінокислот знаходять за калібрувальним гра­фіком, побудованим за стандартним розчином гліцину.

Побудова калібрувального графіка

Початковий розчин готують розчиненням 20 мг гліцину в 50 мл поди (концентрація 400 мкг/мл). З початкового розчину готують ро­бочі розчини розведенням за схемою:

1) 40 мкг/мл — 1 мл вихідного розчину + 9 мл води;

2) 20 мкг/мл — 5 мл розчину 1 + 5 мл води;

3) 10 мкг/мл — 5 мл розчину 2 + 5 мл води;

4) 5 мкг/мл — 5 мл розчину 3 + 5 мл води;

5) 2,5 мкг/мл — 5 мл розчину 3 + 5 мл води.

Для побудови калібрувального графіка проводять реакцію з усіма робочими розчинами гліцину; 2,4 мл гліцерину змішують у пробірці зі шліфом з 2 мл 1 % -го розчину нінгідрину в буфері; струшують до зникнення опалесценції, потім додають 0,6 мл досліджуваного робочого розчину гліцину і знову струшують. Пробірки на шліфах закривають повітряним холодильником і ставлять на 12 хв. у киплячу водяну баню. По закінченню зазначеного часу проби поміщають у холодну воду на 10 хв. (проточна вода). У контрольну пробірку замість розчину гліцину поміщають 0,6 мл цитратного буфера.

Отримані забарвлені проби фотоколориметрують, використовуючи жовтий світлофільтр (А,=570-582 нм). За отриманими даними будують графік залежності оптичної густини від концентрації амінокислоти (0,6 мл розчину).

Хід роботи

З досліджуваними розчинами проводять реакцію з нінгідрином так, як для побудови калібрувальної кривої, тільки замість розчину гліцину додають по 0,6 мл досліджуваної проби. Після вимірювання оптичної густини на ФЕК концентрацію амінокислот у пробі в перерахунку на гліцин знаходять за калібрувальним графіком.

Реактиви

1. 0,5 М цитратний буфер. Готують розчин лимоннокислого нагрію (105,07 г лимонної кислоти поміщають у мірну колбу на 1 л і додають 200 мл 5 н розчину NaOH, після чого водою доводять до позначки. Для отримання буфера з рН=5,5 змішують 27,7 мл 0,5 н NaOH з 72,3 мл лимоннокислого натрію. Буфер зберігають у холодильнику).

2.1 % -й розчин нінгідрину в цитратному буфері. 1 г нінгідрину розчиняють у цитратному буфері рН=5,5. Для повного розчинення нінгідрину колбу поміщають у водяну баню з температурою не вище 70 °С, охолоджують і доводять об'єм до 100 мл буфером. Розчин зберігають у темній склянці не більше трьох днів.

3. Гліцерин.

4. Амінокислота гліцин.

Запитання для самоперевірки

Література

Лабораторна робота №8 білки. Отримання та аналіз білків тваринного і ролинного походження

Мета роботи:

Завдання 1:

Завдання 2:

Завдання 3:

8.1. Отримання кристалічного яєчного альбуміну

Мета роботи полягає в отриманні кристалічного яєчного альбуміну за допомогою висалювання.

Загальні положення

Метод базується на розділенні білків курячого яйця за їх роз­чинністю. Глобуліни висалюють з розчину при 50 % -му насиченні суль­фатом амонію, а розчинений у воді альбумін при 70 %-му насиченні цією самою сіллю, найбільш повне осадження відбувається в ізоелектричній точці.

Хід роботи

Білок двох свіжих яєць відділяють від жовтків і поміщають у мірний циліндр на 100 мл з притертою пробкою. Доливають такий самий об'єм насиченого розчину сульфату амонію. Циліндр закрива­ють пробкою і добре перемішують. При напівнасиченні розчину суль­фату амонію в осад випадають глобуліни. Осад відфільтровують через складчастий фільтр або відділяють центрифугуванням. Отриманий прозорий фільтрат або фугат поміщають в інший мірний циліндр, ви­мірюють об'єм, додають добре розтертий порошок сульфату амонію з розрахунку 13,5 г на 100 мл розчину і добре перемішують скляною паличкою до повного розчинення кристалів. При цьому отримують 70 % -й розчин сульфату амонію, я якого випадає в осад альбумін, Ос­танній відфільтровують на воронці Бюхнера під вакуумом. Осад зніма­ють з фільтрату, переносять у хімічний стакан на 50 мл і розчиняють у мінімальній кількості води. До отриманого розчину додають по крап­лях при перемішуванні 4 %-й розчин оцтової кислоти, контролюючи рН отриманого розчину за універсальним індикаторним папером по досягненні рН 4,7 4,8 до розчину невеликими порціями приливають ннсичоний розчин сульфату амонію при постійному перемішуванні до тих нір, поки з'явиться незникаюча муть. Стаканчик накривають чи-І-тим склом і ставлять у холодильник. Через добу чи більше випада­ють кристали яєчного альбуміну.

Сировина та реактиви

1. Свіжі курячі яйця.

2. Сульфат амонію кристалічний.

3. Насичений розчин сульфату амонію (757 г солі розчиняють у мірній колбі на 1 л при слабкому нагріванні на водяній бані і після охолодження доводять до позначки водою).

4. 4 %-а оцтова кислота.