6.2. Визначення початкової швидкості реакції

Всі кінетичні характеристики ферменту потрібно вивчати для вимірювання початкової швидкості реакції, яка є лінійною функцією концентрації ферменту. Найбільш просто це забезпечується надлиш­ком субстрату.

Потрібно визначити границю концентрації ферменту в розчині., який забезпечує постійну швидкість реакції, тобто лінійну залежність початкової швидкості реакції від концентрації ферменту.

Готують серію розведень початкового розчину глюкозооксида зи, наприклад, які містять в 1 мл 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 і 10 од.

В усіх розведеннях визначають активність глюкозоізомерази (тобто початкову швидкість реакції) за всіх останніх стандартних умов, прийнятих у методиці.

На основі отриманих даних будують графік залежності швид­кості реакції (активності) від концентрації ферменту в розчині і відмічають границю концентрації, вище якої швидкість реакції перестає бути прямо пропорційною концентрації ферменту.

6.3. Визначення константи Міхаеліса

Готують серію концентрацій субстрату. Наприклад, для визначення активності глюкозооксидази використовують розчини глюкози таких концентрацій, %: 5, 10, 20, З0 і 40. Краще почати з більш низької концентрації — 1 % -го розчину глюкози.

Встановлюється активність глюкозооксидази з використанням субстрату всіх наведених концентрацій, всі інші умови реакції залишаються стандартними (рН, температура, іонний склад, час). Отримані дані використовують для побудови графіка залежності швидкості реакції від концентрації субстрату у координатах Лайнуівера—Берка (див. рис. 8.2). Розраховують величини Кт та Утах.

6.4. Визначення типу інгібірування

На прикладі солей важких металів визначають тип інгібірування глюкооксидази іонами важких металів.

Готують розчини солей важких металів (наприклад свинцю, ртуті та ін.) в кількох концентраціях з таким розрахунком, щоб вміст іонів металів в реакційній суміші становив 10^–3...10^–5 М. Визначають активність глюкозооксидази з різними концентраціями субстрату, як описано в п. 6.3, але з добавленням 0,5 мл розчину інгібітора та 4,0 мл ацетатного буфера замість 4,5 мл (наприклад, з двома концентраціями інгібітора).

За одержаними даними будують залежність активності глюкозооксидази від концентрації субстрату в координатах Лайнуівера—Берка у присутності інгібітора та без нього. Визначають тип інгібірування, можна також визначити константу Кі.

8.5. Визначення оптимуму температури і рН

Для визначення оптимальної температури для дії глюкозоокси­дази активність ферменту визначають за стандартною методикою, але при різних температурах, наприклад 10, 15, 20, ЗО і 40 °С. Потрібну температуру забезпечують проведенням реакції у водяній бані з відповідною температурою, при цьому реакційну суміш перемішують вручну. Слід пам'ятати, що перед початком реакції всі реагенти повинні бути витримані при відповідній температурі протягом 10 хв. За одержаними даними будують графік залежності активності глюкозооксидази від температури та визначають температурний оптимум.

Для встановлення рН-оптимуму для дії глюкозооксидази готують серію буферних розчинів з різними значеннями рН. Для їх приготування використовують згідно з довідниковими таблицями 1 н розчин оцтової кислоти і 1 н розчин оцтовокислого натрію, рН буферних розчинів перевіряють потенціометрично. Використовують, наприклад, буферні розчини зі значеннями рН: 3,0; 4,0; 5,0; 5,8 (стандартний); 7,0; 8,0 (для приготування двох останніх буферів до оцтовокислого натрію додають 1 н розчин NаОН).

Визначають активність глюкозооксидази в стандартних умовах, але при додаванні буферних розчинів з різними значеннями рН. За отриманими даними будують залежність активності від рН та визначають оптимальну величину рН, яка забезпечує максимальну активність ферменту.

Контрольні питання

1. Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату.

2. Залежність швидкості ферментативної реакції від температури.

3. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН.

4. Залежність швидкості ферментативної реакції від типу інгібірування.

5. Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації ферменту.

6. Рівняння Міхаеліса—Ментен.

7. Визначення константи Міхаеліса.

8. Принцип методу визначення активності ферменту глюкооксидази.

9. Міжнародна одиниця активності ферменту