2. 1. 7. Визначення гена. Теорія гена
Уявлення про ген змінювались. Спочатку вважали, що ген – відрізок молекули ДНК, у якому закодована інформація про будову одного білка: Дж. Бідл і Е. Тейтем – гіпотеза „один ген – один білок” (1948 р). Потім виявилося, що існують білки, складені з кількох білкових субодиниць. Наприклад, до складу гемоглобіну входить 4 глобінових ланцюги – 2α і 2β, які кодують різні гени. Тому формула, яка виражає зв’язок між геном і ознакою, змінилася: „Один ген – один поліпептид”.
Сучасне визначення гена таке: гени – це ділянки ДНК, які мають унікальну послідовність нуклеотидів, що кодують певні іРНК, тРНК або рРНК або взаємодіють з регуляторним білком. Структурні гени кодують структуру білків та РНК, регуляторні – слугують місцем прикріплення ферментів чи інших біологічно активних сполук, які впливають на активність структурних генів і беруть участь у процесах реплікації ДНК і транскрипції.
Мінімальні за розміром гени складаються із кількох десятків нуклеотидів (гени тРНК), гени макромолекул (рРНК, іРНК) – із кількох сотень або тисяч нуклеотидів, регуляторні гени мають невеликі розміри – кілька десятків пар нуклеотидів. Більша частина генів перебуває в неактивному стані. Кількість генів, з яких у даний момент може зчитуватись (транскрибуватись) інформація, залежить від функціонального стану клітини і стадії онтогенезу.
Гени розташовані у ДНК у лінійному порядку, причому кожен має своє місце розташування – локус. У гомологічних хромосомах алельні гени розташовані аналогічно. Гени еукаріотів4, у тому числі й гени людини, мають екзонно-інтронну структуру, тобто чергування послідовностей нуклеотидів, які кодують білки, – екзонів, і які не кодують – інтронів.
Псевдогени – це високогомологічні копії в геномі, подібні до структурних генів за своєю нуклеотидною послідовністю, але не функціональні через накопичення в них різноманітних мутацій. Псевдогени – копії відомих генів. Вони локалізовані в інших частинах геному, позбавлені інтронів або інактивовані мутаціями, тому не функціонують.
2. 1. 8. Експресія гена в ознаку (транскрипція, процесинг, трансляція, посттрансляційні модифікації білків)
Формування ознак організму залежить від синтезованих у клітинах білків. Структура білків закодована в генах, які містяться в молекулах ДНК. Генетична інформація зберігається в ядрі в хромосомах, потім переноситься із ядра за допомогою іРНК, у цитоплазмі на іРНК і рибосомах синтезуються білки, які можуть зазнавати хімічних модифікацій в каналах шорсткої ЕПС, після чого включаються до складу тих структур, які формують ту чи іншу ознаку організму.
Експресія гена в ознаку – це складний багатоетапний процес, який включає етапи транскрипції, процесингу, трансляції та посттрансляційної модифікації білка.
Транскрипція – це процес синтезу молекули іРНК на молекулі ДНК. Синтез про-іРНК починається з моменту розпізнавання ферментом РНК-полімеразою промотора – спеціальної ділянки в молекулі ДНК, яка є точкою початку транскрипції. Після приєднання до промотора РНК-полімераза розплітає подвійну спіраль ДНК і на одному із ланцюгів синтезує про-іРНК згідно з принципом комплементарності нуклеотидів ДНК (А–У, Т–А, Г–Ц, Ц–Г).
Оскільки РНК-полімераза може приєднувати нуклеотиди лише від 5′–кінця до 3′-кінця, то матрицею для синтезу іРНК може бути лише один ланцюг ДНК – обернений до ферменту своїм вільним 3′–кінцем, тобто має напрямок 3′→5′. Цей ланцюг ДНК називають кодогенний. На ньому відбувається синтез про-іРНК антипаралельно ДНК у напрямку 5′→3′. Антипаралельність з’єднання двох ланцюгів ДНК дозволяє РНК-полімеразі правильно обрати матрицю для синтезу про-іРНК. Пересуваючись уздовж кодогенного ланцюга ДНК, РНК-полімераза здійснює поступове точне переписування генетичної інформації доти, доки не зустріне іншу специфічну послідовність нуклеотидів – термінатор транскрипції. У цій ділянці ДНК РНК-полімераза відділяється і від ДНК, і від про-іРНК. Ланцюги ДНК при цьому відновлюють водневі зв’язки і знову об’єднуються у подвійну спіраль. Утворена під час транскрипції про-іРНК містить точну копію інформації, записаної на певній ділянці ДНК, з якої вона була транскрибована.
Фрагмент молекули ДНК, який містить промотор, транскрибовану послідовність і термінатор, утворює одиницю транскрипції – транскриптон.
Процесинг – процес дозрівання про-іРНК, у ході якого здійснюється переведення первинного транскрипту в активну форму іРНК: видалення із про-іРНК інтронів і зшивання екзонів, а також модифікація кінцевих послідовностей про-іРНК. Процесинг відбувається в ядрі, а в цитоплазму клітини виходить лише зріла іРНК. Сплайсинг – процес зшивання екзонів після видалення інтронів із первинного транскрипту.
Трансляція – синтез білка на рибосомі. Під час трансляції генетичний текст іРНК перетворюється на послідовність амінокислот у молекулі білка. Цей процес можна поділити на 2 етапи, які мають різну локалізацію в клітині: рекогніція (розпізнавання АК), що перебігає в цитоплазмі, та біосинтез білка – на рибосомах.
Рекогніція – розпізнавання АК та її зв’язування з певною тРНК. Молекула тРНК здатна „зчитувати” нуклеотидний текст (антикодон специфічно спарюється з кодоном) і нести на собі певну АК (на акцепторному кінці). Однак приєднати до себе відповідну амінокислоту тРНК не може. Для цього у цитоплазмі є спеціальні ферменти, які забезпечують розпізнавання тРНК певної АК – це аміноацил-тРНК-синтетази, яких ≈ 20. Вони приєднують АК карбоксильною групою до гідроксилу (3′–ОН), який є на акцепторному кінці тРНК.
Біосинтез білка умовно поділяють на 3 фази: ініціація, елонгація та термінація.
Ініціація – початок трансляції – це об’єднання двох субодиниць рибосом на певній ділянці іРНК і приєднання до першого кодону іРНК (АУГ) першої аміноацил-тРНК, яка несе першу АК – метіонін. Ці процеси каталізують спеціальні білки – фактори ініціації, які рухомо зв’язуються з малою субодиницею рибосоми, а після утворення ініціального комплексу відділяються від неї. Точка приєднання іРНК до субодиниці рибосоми розміщена поряд з її 5′–кінцем, оскільки зчитування інформації відбувається у напрямку 5′→3′. До складу ініціального комплексу входять іРНК, рибосома та 1-ша аміноацил-тРНК.
На цій стадії в рибосомах утворюються функціональний центр – 2 ділянки: 1) А-ділянка (аміноацильна) рибосоми, у якій розміщена аміноацил-тРНК, яка несе певну амінокислоту; 2) П-ділянка (пептидильна) – ділянка рибосоми, у якій розташована тРНК, що несе пептидний ланцюг. Наприкінці стадії ініціації в П-ділянці рибосоми розміщується тРНК з амінокислотою метіоніном.
Фаза елонгації – подовження пептиду – включає усі реакції від моменту утворення 1-го пептидного зв’язку до приєднання останньої АК (рис. 3). При цьому циклічно відбуваються такі процеси: специфічне розпізнавання аміноацил-тРНК чергового кодону, який є в А-ділянці рибосоми, внаслідок взаємодії кодону з антикодоном → утворення пептидного зв’язку між тією амінокислотою, яка знаходиться в П-ділянці рибосоми, та амінокислотою, яка знаходиться в А-ділянці → втрата зв’язку між амінокислотою, що була в П-ділянці, та її тРНК→ приєднання
Рис. 3. Фаза елонгації у процесі біосинтезу білка
а – І етап (аміноацил-тРНК приєднується до кодона, розміщеного в А-ділянці); б – ІІ етап (між амінокислотами, розташованими в А- і П-ділянках, утворюється пептидний зв’язок; тРНК, розташована в П-ділянці, звільнюється від своєї амінокислоти і залишає рибосому); в – ІІІ етап (рибосома переміщується по іРНК на 1 кодон так, що тРНК з пептидним ланцюгом переходить із А-ділянки в П-ділянку; вільна А-ділянка може бути зайнята відповідною амінокислотою).
цієї амінокислоти до аміноацил-тРНК, яка в цей час розміщується в А-ділянці рибосоми → вивільнення тРНК із П-ділянки та її переміщення в цитоплазму → рибосома робить крок по іРНК → переміщення тРНК з пептидним ланцюгом із А-ділянки в П-ділянку → розпізнавання наступного кодону антикодоном і т.д. Так відбувається доти, доки в А-ділянці рибосоми не з’явиться стоп-кодон, для якого немає амінокислоти.
Фаза термінації – завершення синтезу поліпептиду – відбувається після розпізнавання стоп-кодону специфічним білком, який є в рибосомі. При цьому до останньої АК в пептидному ланцюзі приєднується вода і її карбоксильний кінець відділяється від тРНК. Після цього пептидний ланцюг втрачає зв’язок з рибосомою, а сама рибосома розпадається на дві субодиниці.