Хід виконання роботи

Визначення загальної кількості бактерій у воді.

Визначають у 1 см³ води КМАФАнМ, здатних рости на середовищі при температурі 30 ºС впродовж 24 год. Як правило, на чашку Петрі засі­вають 1 см³ води. Якщо відомо, що вода брудна, роблять розбавлення і з кожного розбавлення засівають по 1 см³. У чашки Петрі заливають 10-12 см³ охолодженого до 45⁰С МПА, швидко перемішують, обертаючи чашки, не відриваючи їх від поверхні столу. Після застигання середовища чашки Петрі догори дном ставлять у термостат при 30 ºС і культивують протягом 24 год.

Колонії, що виросли як на поверхні, так і в глибині агару, підраховують. Оцінюють тільки ті розбавлення, при посіві яких на чашках Петрі виросло від 30 до 300 колоній. Результати підрахунку колоній у кожній чашці виражають у колонієутворюючих одиницях на 1 см³ аналізованої води. Ре­зультати заносять у табл.1. Порівнявши отримані результати з нормативними, роблять висновок про якість аналізованої води. За наявності в 1 см³ 0-100 колоній мікроорганізмів вода вважається чистою, 100-1000 - сумнівної якості, понад 1000 непридатною до використання у виробництві й без попередньої обробки для вживання людиною.

Таблиця 1- Мікробіологічні показники якості води.

Категорія води	КМАФАнМ, КУО/см3		Висновок
	норматив	результат
Вода питна водопровідна	Не більше 100
Вода артезіанська	Не більше 100
Вода питна з колодязів, джерел	Не більше 1000

Визначення кількості бактерій групи кишкових паличок.

Виявлення у воді бактерій групи кишкових паличок варто розглядати як показник фекального забруднення води, а їхня кількість дає змогу оцінювати ступінь цього забруднення.

Кількість БГКП визначають двома методами: методом мембранних фільтрів і бродильним методом.

У лабораторії мікробіології харчових продуктів використовують:

Метод мембранних фільтрів. Метод одержав широке поширення в лабораторіях харчових підприємств. У порівнянні з іншими методами має ряд переваг, тому що скорочує термін аналізу до 24 год, менш трудомісткий, дає можливість виявити самі незначні кількості мікроорганізмів у воді, проводити прямий і точний підрахунок колоній і виділяти їх у чисту культуру.

Мембранні фільтри являють собою пористі нітроцелюлозні плівки діаметром від 37 мм і товщиною 0,1 мм. Для кількісного обліку мікроорганізмів у воді застосовують фільтри з діаметром пор не більше 0,45 мкм. Попередні фільтри, призначення яких очистити воду від грубих часток, мають пори діаметром 3-5мкм.

Для фільтрування користуються фільтрувальною воронкою, яку стерилізують в автоклаві або за допомогою змоченого спиртом тампона й випалювання. Мембранні фільтри виймають із фабричної упаковки й перевіряють на відсутність ушкоджень - тріщин, розривів, надламів. Перед використанням фільтри поміщають у склянку зі стерильною водою, підігрітою до 50-60 ºС витримують 20-30 хв, після чого воду зливають і заміняють свіжою. Підготовлений фільтр захоплюють стерильним пінцетом із гладкими краями й укладають матовою стороною нагору на пластинку, що лежить на металевій сітці приладу. На фільтр обережно встановлюють лійку, щільно закріплюють металевими затискачами або загвинчують. У лійку наливають досліджувану воду й прилад з'єднують із водоструминним електричним насосом або насосом Камовського.

При дослідженні водопровідної води (пива, безалкоголь напоїв, промивних вод) для аналізу беруть 300-500 см³. Аналіз напівфабрикатів (купажів, сиропів і т.д.) проводять після їх попереднього розбавлення стерильною водою до концентрації готових напоїв. Для води, досліджуваної вперше, варто брати 1000, 500, 100, 10, 5 і 1 см³. Дуже забруднені води перед фільтруванням розбавляють стерильною водою. Якщо фільтрують 1 см³ рідини й менше, у лійку фільтрувального приладу наливаю близько 10 см³ стерильної води, потім вносять досліджувану пробу.

Після закінчення фільтрування лійку знімають і обпаленим пінцетом переносять фільтр у чашку Петрі на поверхню середовища Ендо чи іншого середовища повітряною матовою стороною догори, уникаючи утворення пухирців повітря між cepeдовищем і фільтром. Краплі води на нижній стороні фільтра попередньо видаляють стерильним фільтрувальним папером. На дні чашки під фільтром роблять напис із зазначенням дати посіву, номера аналізу й об'єму профільтрованої води. Посіви вирощують у термостаті при 37 ºС впродовж 18-24 год. Після закінчення термостатування за допомогою лупи підраховують колонії, типові для кишкової палички. 3 2-3 колоній роблять мазки й зафарбовують за Грамом.

Бродильний метод. Метод полягає в посіві визначених об'ємів аналізованої води і культивуванні їх при 37 ºС в середо­вищах накопичення з наступним висівом бактерій на щільне середовище Ендо, диференціюванні вирослих колоній і визначенні найбільш ймовірного числа (НВЧ) бактерій групи кишкових паличок у 1000 см³ води за табл. 2.

Для проведення аналізу засівають 100, 10, 1 і 0,1 см³ води. 100 і 10 см³ води поміщають у флакони (можна використовувати калібровані пляшечки від дитячого харчування) і додають концентроване глюкозо-пептоне середовище (склад середовища: 100 г пептону, 50 г NaCl, 50г глюкози на 1 л здистильованої води. Потім додають індикатор Андреде, рН 7,4-7,6. Стерилізація при 112 ºС, 0,05 мПа, 12 хв).

Таблиця 2 - Визначення колі-індексу бактерій групи кишкових паличок при дослідженні 300 см³ води

Кількість позитивних результатів аналізу води			Колі-індекс	Межі індексу		Колі-титр
З флаконів ємністю по 100 см3	З пробірок ємністю по 10 см3	З пробірок ємністю по 10 см3		нижня	верхня
1	2	3	4	5	6	7
0	0	0	Менше3	-	-	Більше333
0	0	1	3	0,5	9	333
0	1	0	3	0,5	13	333
1	0	0	4	0,5	20	250
1	0	1	7	1	21	143
1	1	0	7	1	23	143
1	1	1	11	3	36	91
1	2	0	11	3	36	91
2	0	0	9	1	36	111
2	0	1	14	3	37	72
2	1	0	15	3	44	67
2	1	1	20	7	89	50
2	2	0	21	4	47	48
2	2	1	28	10	149	86
3	0	0	23	4	120	43
3	1	0	43	7	210	23
3	1	1	75	14	230	13
3	1	2	120	30	380	8
3	2	0	93	15	380	11
3	2	1	150	30	440	7
3	2	2	210	35	470	5
3	3	0	240	36	1300	4
3	3	1	460	71	2400	2
3	3	2	1100	150	4800	0,9
3	3	3	Більше1100	-	-	Менше0,9

До 100 см^З аналізованої води додають 10 см^З концентрованого середовища; до 10 см^З - 1 см^З, 1 см^З і 0,1 см^З аналізованої води додають у середовище Кесслера.

Всі операції повторюють тричі. Після культивування визначають НВЧ за табл. 2 і результати заносять у табл. 3.

Порівнявши отримані результати з нормативними, роблять висновок про якість аналізованої води.

Таблиця 3 - Санітарно-мікробіологічні показники води

Категорія води	Показники				Висновок
	Колі-титр, см3		Колі-індекс
	норматив	результат	норматив	результат
Вода питна водопровідна	Не менше 300		Не більше 3
Вода питна з колодязів, джерел	Не менше 100		Не більше 10

Колі-титр – це найменший об’єм води, в якому виявляється одна клітина БГКП.

Мікрофлора повітря

Повітря є несприятливим середовищем, для існування і розвитку мікроорганізмів. Потрапляючи в повітря, вони швидко гинуть внаслідок висихання, дії сонячних променів і нестачі поживних речовин. Склад мікрофлори повітря дуже різноманітний. Він залежить від ступеню забрудненості повітря мінеральними та органічними речовинами, температури, вологості тощо. Серед мікроорганізмів, які найчастіше виявляються в повітрі, переважають спороносні бактерії родів Bacillus, Clostridium, цвільові гриби, які найбільш стійкі до висихання, а також пігментовані бактерії родів Micrococcus, Sаrcina, Serratia, які стійкі до дії ультрафіолетових промінів. Мікроорганізми у повітря потрапляють, головним чином, з грунту.

Людина в середньому за добу вдихає 12000-14000 л повітря, при цьому 99,8% мікробів, які містяться в повітрі, затримуються у дихальних шляхах. У повітрі закритих приміщень виявляють бактерії, які виділяються зі слизових оболонок верхніх дихальних шляхів людини при чханні, кашлі, розмові. Від хворих у повітря виділяються поряд з умовнопатогенними мікроорганізмами (стафілококами, стрептококами) патогенні мікроби (гемолітичні стрептококи, бактерії дифтериту, кашлюку, мікобактерії туберкульозу та інші). При дослідженні повітря закритих приміщень важливим є метод вловлювання мікроорганізмів із повітря. Залежно від цього розрізняють седиментаційні, фільт раційні та аспіраційні методи дослідження повітря.

В основі усіх методів лежить однаковий принцип підрахунку бактерій. Вважають, що кожна бактерія, яка потрапила на агаризоване поживне середовище, розмножується, утворюючи колонію, яку можна побачити неозброєним оком. За кількістю підрахованих колоній розраховують кількість бактерій, вловлених про аналізі повітря.

Метод вловлювання повітря рідинами належить до фільтраційних методів. Певний об’єм повітря продувають через певний об’єм рідини (стерильна вода, буфер, рідке поживне середовище). По 0,1 мл цієї рідини висівають у чашки Петрі на тверде поживне середовище.

Чашки інкубують у термостаті. Через певний час підраховують кількість колоній, що виросли на чашках. При обчисленні кількості мікроорганізмів у повітрі враховують об’єм рідинипоглинача та об’єм повітря, яке пройшло через рідину.

Аспіраційний метод з використанням апарата Кротова.

Конструкція апарата Кротова грунтується на принципі ударної дії струменя повітря. Апарат складається з трьох частин: вузла для відбору 38 проб повітря, мікроманометра те електромотора. Апарат може пропускати від 25 до 50 л повітря за хвилину.

“Засіяні повітрям” чашки інкубують у термостаті. Через певний час підраховують кількість колоній, які виросли на них. Результати аналізу виражають найчастіше мікробним числом – кількістю мікроорганізмів у 1 м3 повітря.

Метод осадження Коха належить до седиментаційних. Метод дає можливість виявити лише 35-60% мікробів повітря і дозволяє тільки орієнтовано оцінити чистоту повітря. Принцип методу полягає в тому, що мікроорганізми повітря досліджуваного приміщення разом з пилом осаджуються на поверхню поживного агару в чашці Петрі. Час осадження залежить від забрудненості повітря. “Засіяні повітрям” чашки інкубують у термостаті, а через 2-3 дні підраховують кількість колоній на них.

Розрахунки мікробного числа виконують за формулою Омелянського:

x=

де: х – кількість мікроорганізмів в 1 м³ повітря;

п – кількість колоній мікроорганізмів, які виросли у чашці Петрі;

t – час осадження, хв;

F – площа чашки Петрі, см²;

5 і 10⁴ – коефіцієнти для перерахунку кількості мікроорганізмів у 1 м³.

Омелянським була складена таблиця розрахунку, користуючись якою можна розрахувати загальну кількість мікроорганізмів в 1 м³ повітря.

У табл. 4 дані постійні множники, на які треба множити отримані кількості колоній залежно від діаметра й площі чашки Петрі, на якій робився посів. Наприклад, на чашці Петрі площею 63 см² виросло 25 колоній. Кількість мікробів в 1 м³ повітря буде дорівнювати (25х80) 2000 клітин. Підрахувавши колонії на своїх чаш ках Петрі й розрахувавши кількість клітин мікроорганізмів в 1 мз повітря, студенти порівнюють з табл. 5. По­вітря виробничих приміщень вважається чистим, якщо в ньому міститься не більше 500 КУО в 1 м³.

Порівнявши отримані результати з нормативом оцінки повітря закритих приміщень, зробити висновок про чистоту повітря в лабораторії. Після кількісного підрахунку зробити якісний аналіз мікрофлори повітря.

Найчастіше у повітрі зустрічаються різні види мікрококів:

Місуососсиs аlbиs, Micrococcus roseuт, Місуососсиs rиbrит, а також Sarciпa flava, Sarciпa тахіта та спороутворювальні бактерії - Васillиs тeseпtericus, В. subtitlis, В. тegateriuт, В. тycoides, з грибів виявлені пеніцилові, аспергилові, мукорові. Рідше виявляють деякі дріжджі.

Таблиця 4 - Розрахунок числа колоній в 1 м³ повітря (за Омелянським)

Діаметр чашки, см	Площа чашки, см2	Множник розрахунку числа мікробів в 1 м3 повітря
8	50	100
9	63	80
10	78	60
11	95	50
12	113	45

Для визначення загального мікробного забруднення проби повітря “висівають” на МПА. Для виявлення у повітрі дріжджів та цвілей використовують сусло-агар.

Патогенні мікроорганізми виявляють на відповідних диференційнодіагностичних живильних середовищах, зокрема, гемолітичні стрептококи та стафілококи – на кров’яному агарі.

Офіційних стандартів чистоти повітря не розроблено, але прийнято такі показники оцінки ступеня мікробного забруднення приміщень: Число мікроорганізмів у 1 м³ повітря.

Таблиця 5 - Оцінка повітря

Оцінка чистоти повітря	Літній період		Зимовий період
	всього мікроорганізмів	гемолітичні бактерії	всього мікроорганізмів	гемоліти-чні бактерії
чисте	<1500	<16	<4500	<36
забруднене	>2500	>36	>7000	>124