1.7 Идентификация пост-трансляционных модификаций

Часть пептидов, содержащихся в подготовленной для МС-анализа пробе, так или иначе, модифицированы, соответственно, модификации можно разделить на две группы:

• Пост-трансляционные модификации, являющиеся следствием присоединения каких-либо функциональных групп. Например, фосфорилирование, ацетилирование и т. п.

• Модификации, возникшие в процессе пробоподготовки.

Эти модификации представляют наибольший интерес, поскольку именно они связаны с жизненным циклом клетки. Методами масс-спектрометрии легко детектируют модификации первого типа. (МС-МС)-анализ зачастую позволяет выявить место присоединения фосфатного остатка - аминокислоту в последовательности пептида. Современным методом хроматографического разделения и получения образца, обогащенного фосфорилированными пептидами, является металл-аффинная хроматография.

Каждая из модификаций проявляется в масс-спектрах за счет характерного изменения массы аминокислотного остатка. Во фрагментных спектрах это выглядит как смещение серий пиков на определенную величину, соответствующую массе присоединенной функциональной группы. Именно по этой разнице и, в некоторых случаях, по нейтральным потерям, определяется точная локализация модификации.

1.8 Аддукты зомана с сывороточным альбумином

Альбумин – основной белок плазмы крови, его доля составляет (55- 65)% от всех белков плазмы. Структура и аминокислотная последовательность альбумина хорошо изучены. Так альбумин человека (HSA) имеет в своем составе 585 аминокислот и каждому аминокислотному остатку присвоен свой номер в последовательности. Альбумин поддерживает коллоидно-осмотическое давление плазмы, является транспортным белком и депо для большего количества неполярных молекул и лекарственных веществ, а так же служит эндогенным источником аминокислот. В основе транспортной функции альбумина лежит его способность давать комплексы с различными соединениями, в частности с билирубином, антибиотиками, гормонами, жирными кислотами, барбитуратами и многими другими веществами, а также с отдельными ионами кальция. Кроме того, в состав сывороточного альбумина входит достаточно аминокислот, содержащих гидроксигруппы, что делает его вероятной мишенью присоединения ФОС, в число которых входит зоман (условное название GD). Зоман - производное метилфосфоновой кислоты, боевое отравляющее вещество, проявляющее нервнопаралитическое действие по отношению к животным.

Рисунок 1.8.1 - Пинаколиловый эфир метилфторфосфоновой кислоты (зоман)

С помощью метода масс-спектрометрии было выявлено, что сывороточный альбумин человека способен ковалентно связываться, образуя прямые аддукты, со многими ФОС: параоксоном [3], VX, DFP (диизопропилфторфосфат), зарином, зоманом (рисунок 1.8.2), табуном, CPO (хлорпирифос оксон), ФП-биотином и дихлофосом [23,24]. Было установлено, что наиболее прочные аддукты с ФОС образует аминокислота тирозин-411 (Y-411), которая находится на поверхности белка, при этом остаток ФОС не гидролизируется со временем [25].

Рисунок 1.8.2 - Механизм присоединения зомана к тирозину.

Следует отметить, что альбумин достаточно удобен для масс-спектрометрического анализа, поскольку он содержит достаточное количество аминокислотных остатков лизина и аргинина (а именно по этим сайтам происходит разрыв пептидных связей при проведении триптического гидролиза), что дает хороший набор триптических пептидов с массами, подходящими для масс-спектрометрического детектирования. Выбор альбумина так же обусловлен его доступностью. Во-первых, коммерческий препарат достаточно дешев, во-вторых, альбумин может быть легко выделен.

Однако, существуют определенные трудности при поиске пептидов, модифицированных фосфорсодержащими соединениями, который может быть осложнен тем, что, во-первых, обычно количество сигналов модифицированных пептидов в спектре меньше, чем немодифицированных, и, во-вторых, интенсивность сигналов модифицированных пептидов значительно ниже.

Образование аддукта с участием Y-411 и GD значительно зависит от применяемых концентраций ФОС. Полное модифицирование на Y-411 было достигнуто при инкубации с четырехкратным молярным избытком зомана. Для сравнения, было установлено, что 40-кратный молярный избыток DFP и дихлофоса полностью модифицировал Y-411 в чистом альбумине [26]. При обработке эквимолярными количествами или при небольшом стехиометрическом недостатке соотношения сигналов GD-меченых пептидов к общей интенсивности пептида имеют значения в диапазоне от 10% и 40%. Самое низкое молярное соотношение HSA/GD, которое позволяло обнаружить аддукт Y-411 - 1/0.02, соответствующие 13 μM GD (2,4 мкг/мл)[27].

В этой связи, требуется тщательная разработка новых подходов и методик обогащения пептидных смесей фосфорсодержащими пептидами с использованием таких методов, как металл-аффинная хроматография, в том числе, разработка новых эффективных и специфичных металл-аффинных сорбентов.

Таким образом, целью работы является:

Разработка нового металл-аффинного сорбента, на основе регулярных мономолекулярных наноструктур, содержащих Fe (III) (РММС (FeIII)) для специфичного выделения фосфорсодержащих пептидов из биологических образцов.

Задачи:

1. Отработать метод получения РММС Fe(III).

2. Провести охарактеризацию полученного сорбента. Определить сорбционную емкость, удельную поверхность и электроповерхностные свойства сорбента.

3. Опробовать РММС (Fe III) в качестве металл-аффинного сорбента для обогащения биологического образца фосфорилированными пептидами на примере суммарного белка молока коровы.

4. Показать возможность использования РММС (Fe III) в качестве металл-аффинного сорбента для прободготовки, в исследовании, посвященном масс-спектрометрическому обнаружению и идентификации аддуктов сывороточного альбумина человека с зоманом.