1.4 Maldi масс-спектрометрия
Масс-спектрометрия является одним из наиболее универсальных инструментов при анализе сложных белковых проб, который позволяет не только идентифицировать белок в смеси, но так же установить последовательность аминокислот и идентифицировать модификацию белка.
Для исследования белка наиболее подходящими являются мягкие методы ионизации, например ионизация лазерной десорбцией в присутствии матрицы (Matrix-Assisted Laser Desorbtion/Ionization, MALDI).
Метод MALDI основан на воздействии импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой химическое соединение, которое способно возгоняться под воздействием лазера и захватывать с собой молекулы нелетучих термолабильных аналитов. Кроме того, матрица способствует, ионизации анализируемого вещества. Наиболее распространенными матрицами являются: 2,5-дигидробензойная кислота (DHB), α-циано-4-гидроксикоричная кислота (CHCA) (рисунок1.4.1).
2,5-дигидроксибензойная к-та -циано-4-гидроксикоричная к-та
Рисунок 1.4.1 - Наиболее распространенные матрицы
Поверхность образца (по сравнению с площадью последующего облучения) не является однородной. При облучении в выбранной точке лазерным лучом происходит испарение матрицы вместе с анализируемым веществом и дальнейшая их ионизация [16] (рисунок 1.4.2)
Рисунок 1.4.2 - Схема образования ионов в MALDI.
Процесс образования ионов можно разделить на две стадии. Первая стадия связана с образованием ионов из нейтральных молекул, как правило, она относится к ионам матрицы (МТ). Вторая стадия имеет отношение к последующей ионизации анализируемого вещества (МА).
Возбуждение молекул, которое может протекать несколькими способами, сопровождается фотоионизацией. Далее протекает множество фотохимических реакций. В результате может образоваться набор ионов, которые участвуют в последующей стадии ионизации анализируемого соединения. Часть процессов, происходящих с молекулами матрицы, может относиться и к молекулам анализируемых соединений. Большая (на 5-6 порядков) концентрация молекул матрицы по сравнению с анализируемыми соединениями позволяет считать, что ионизация последних осуществляется в результате переноса электрона или Н+ [17]
Таким образом, при рассмотрении MALDI-масс-спектра мы наблюдаем пики, относящиеся к фрагментам матрицы (в диапазоне (100-400) Да, что затрудняет масс-спектрометрический анализ аминокислот и небольших пептидов) и анализируемого вещества. Кроме того, достаточно часто регистрируются ионы, относящиеся к комплексу матрица - аналит, что всегда необходимо учитывать при интерпретации масс-спектров.
Обобщая данные, можно сказать, что метод MALDI характеризуется небольшой фрагментацией анализируемого вещества, возможностью работы с многокомпонентными смесями; при ионизации в основном образуются однозарядные ионы, что значительно облегчает интерпретацию спектров. Кроме того, мягкие методы ионизации не являются количественными. Это вызвано тем, что соотношение интенсивности регистрируемых ионов, если это не проверено в специальных экспериментах, не отражает соотношения концентраций ионов, присутствующих в смеси. Подобные расхождения вызваны тем, что сродство к протону, гидрофобность, молекулярная масса соединений, состав веществ, присутствующих при измерении, у разных соединений существенно различаются. Кроме того, интенсивность пиков зависит от условий эксперимента и параметров регистрации [18-21].