Минобрнауки России

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)

УГС 240000 Химическая и биотехнологии

Специальность 240307 Технология средств химической защиты

УДК 661.183.2

Факультет инженерно-технологический

Кафедра химической технологии материалов и изделий сорбционной техники

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА ИНЖЕНЕРА

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

ТЕМА Разработка металл аффинных сорбентов на основе регулярных мультимолекулярных структур

Дипломник _________________________ Кельциева О.А.

(подпись, дата)

Санкт-Петербург

2011

Заведующий кафедрой профессор, д-р хим. наук	_____________________________	Н.Ф. Федоров
Руководители канд.хим.наук,стар.науч. сотр., канд.техн.наук,доцент	_____________________________ _____________________________	Подольская Е.П. Л.В.Григорьева
Консультанты:
по экономике: ст.преподаватель	_____________________________	К.Г. Нужная
по охране труда и окружающей среды доцент, канд.хим.наук.	_____________________________	З.В. Капитоненко
Нормоконтролер
канд.техн.наук, доцент	__________________________________	Л.В. Григорьева

Санкт-Петербургский государственный технологический институт

(Технический университет)

ЗАДАНИЕ

на выпускную квалификационную работу инженера

Дипломнику Кельциевой Ольге Александровне

Факультет инженерно-технологический

Кафедра химической технологии материалов и изделий сорбционной техники

Тема Разработка металл аффинных сорбентов на основе регулярных мономолекулярных структур

Утверждена приказом по институту от 12 сентября 2011г., № 392-032

Исходные данные к работе:

Е.А.Рожкова, И.А.Краснов, Н.Г.Суходолов, Е.П.Подольская, А.И.Янклович, Н.В.Краснов. Исследование свойств наноструктур (пленок Лэнгмюра-Блоджетт), содержащих ионы железа, и определение их состава с привлечением методов масс-спектрометрии. Научное приборостроение 2008, Т.18. №4.С.54-61.

Виды и объем работ, выполняемых с использованием ЭВМ и САПР:

оформление пояснительной записки дипломной работы с использованием программы Microsoft Office Word 2003 в объеме 100 страниц; оформление графиков с использованием офисной программы Microsoft Office Excel 2003, создание презентации с использованием программы Microsoft Office PowerPoint 2003; использование средств Internet.

Консультанты по работе:

по экономике – старший преподаватель К.Г.Нужная, по охране труда и окружающей среды – доцент З.В.Капитоненко.

Дата выдачи задания 12.09.2011 года

Дата представления выпускной квалификационной работы к защите 22.12.2011

Заведующий кафедрой профессор, д-р хим. наук	_______________________	Н.Ф. Федоров
Руководители канд.хим.наук,стар.науч. сотр.,	________________________	Подольская Е.П.
канд.техн.наук,доцент	________________________	Л.В.Григорьева

Реферат

Отчет содержит 99 страниц, 5 таблиц, 26 рисунков, список литературы 53 источника, приложения А,Б,В (25 стр., 12 табл.).

РЕГУЛЯРНЫЙ МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫЙ СОРБЕНТ, РММС (Fe III), МЕТАЛЛ-АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ ПЕПТИДЫ, ЗОМАН, СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН, АДДУКТЫ ПЕПТИДОВ С ОСТАТКАМИ ФОС.

В настоящей работе представлены результаты по разработке и охарактеризации сорбента на основе регулярных мультимолекулярных структур, содержащих ионы железа (III).

Ранее были разработаны регулярные мономолекулярные наноструктуры на основе солей стеариновой кислоты и масс-спектрометрически определено, что основным структурным звеном является дистеарат, притом, что для трехвалентных металлов третий заместитель может быть вариабельным. В этой связи возникло предположение, что описанные структуры могут быть использованы в качестве металл-аффинных сорбентов, специфичных для фосфорилированных пептидов (сорбента, содержащих ионы трехвалентных металлов, в нашем случае - Fe(III)). Металл-аффинный анализ проводили с использование коммерческого фосфорилированного пептида. Показано, что пептид успешно сорбируется на коллапсированных монослоях и элюируется раствором аммиака. Емкость сорбента составила ~ 2,5% от массы по пептиду с молекулярной массой 1500 Да. Удельная поверхность ~ 4 м². Показано, что по сорбционной емкости новый сорбент превышает коммерческий аналог (PHOS -Select Affinity Gel) более чем в 20 раз.

Новый сорбент был успешно протестирован на сложных образцах, содержащих фосфонилированные пептиды. Стоит отметить, что для сорбента, обладающей столь малой удельной поверхностью монослои показывают очень высокую сорбционную емкость. Предположительно это связано с высокой концентрацией ионизированных атомов Fe на поверхности сорбента. Также стоит отметить, что данных сорбент очень удобен, как инструмент пробоподготовки к масс-спектрометрическому анализу, поскольку элюат может быть проанализирован без дополнительных стадий, таких как обессоливание, или концентрирование.

0. Содержание

Содержание 6

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ 8

ВВЕДЕНИЕ 9

1 Аналитический обзор 11

1.1 Регулярные мультимолекулярные структуры 11

1.2 Хроматография 12

1.2.1 Металл-аффинная хроматография – сочетание принципов лигандообменной и аффинной хроматографии 15

1.3 Методы характеризации сорбентов 17

1.3.1 Удельная поверхность 17

1.3.2 Емкость сорбента, влажность 18

1.3.3 Электрокинетический потенциал 18

1.4 MALDI масс-спектрометрия 19

1.5 Идентификация белков – метод PMF 21

1.6 Тандемная масс-спектрометрия (МС-МС) и идентификация пептиов по фрагментным масс-спектрам 22

1.7 Идентификация пост-трансляционных модификаций 24

1.8 Аддукты зомана с сывороточным альбумином 25

2 Методическая часть 29

2.1 Используемые материалы: 29

2.2 Методики получения сорбента и исследования 30

2.2.1 Получение РММ (FeIII) сорбента 30

2.2.2 Определение удельной поверхности сорбента 30

2.2.3 Определение сорбционной емкости сорбента 30

2.2.4 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы 32

2.2.5 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека 33

2.2.6 Масс-спектрометрический анализ 33

3. Экспериментальная часть 37

3.1. Получение РММ Fe(III) сорбента 37

3.2 Определение удельной поверхности 37

3.3 Определение электрокинетического потенциала и размера частиц. 37

3.4 Определение сорбционной емкости сорбента 38

3.4.1Проведение металл-аффинного анализа 38

3.4.2 Определение содержание пептида в проскоке и контрольном образце 38

3.4.3 Определение влажности коммерческого сорбента и РММС Fe(III) 39

3.5 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы 39

3.5.1 Приготовление микроколонки с сорбентом 39

3.5.2 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте 39

3.5.3 Металл-аффинная хроматография на РММС Fe(III) 40

3.6 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека 40

3.6.1 Приготовление металл-аффинной колонки 40

3.6.2 Выбор элюэнта 41

3.6.3 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте 41

3.6.4 Металл-аффинная хроматография на РММС Fe(III) 42

3.7 Масс-спектрометрический анализ 43

3.7.1 Проведение масс-спектрометрического анализа 43

4 Обсуждение результатов эксперимента 44

4.1 Охарактеризация сорбента 45

4.1.1. Получение РММ сорбента, содержащего ионы железа (III) и приготовление хроматографических колонок. 45

4.1.2 Определение удельной поверхности 46

4.1.3 Определение емкости сорбента 47

4.1.4 Микроэлектрофоретические исследования. 49

4.2 Исследование возможности специфичного выделения фосфорилированных пептидов из биологического образца методом металл-аффинной хроматографии с использованием РММС(Fe III) 52

4.3 Разработка метода металл-аффинного выделения прямых ковалентных аддуктов зомана с сывороточным альбумином с помощью РММ сорбентов Fe(III) для последующего масс-спектрометрического анализа 56

4.3.1 Поиск и идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с зоманом 56

4.3.2 Выделение фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека с использованием РММС (Fe III) 63

4.3.2 Масс-спектрометрическая идентификация сайтов связывания зомана с альбумином при взаимодействии с белками in vitro 68

ВЫВОДЫ ПО РАБОТЕ: 71

Список использованных источников. 72

Приложение А 78

PHOS-Select Iron Affinity Gel, Sigma * 80

Ультразвуковая мойка Bransonic 1510E 84

Приложение Б 89

Приложение В 103

Приложение Г 104