
- •Содержание
- •1 Аналитический обзор 11
- •2 Методическая часть 29
- •3. Экспериментальная часть 37
- •4 Обсуждение результатов эксперимента 44
- •Условные обозначения
- •Введение
- •1 Аналитический обзор
- •1.1 Регулярные мультимолекулярные структуры
- •1.2 Хроматография
- •1.2.1 Металл-аффинная хроматография – сочетание принципов лигандообменной и аффинной хроматографии
- •1.3 Методы характеризации сорбентов
- •1.3.1 Удельная поверхность
- •1.3.2 Емкость сорбента, влажность
- •1.3.3 Электрокинетический потенциал
- •1.4 Maldi масс-спектрометрия
- •1.5 Идентификация белков – метод pmf
- •1.6 Тандемная масс-спектрометрия (мс-мс) и идентификация пептиов по фрагментным масс-спектрам
- •1.7 Идентификация пост-трансляционных модификаций
- •1.8 Аддукты зомана с сывороточным альбумином
- •2 Методическая часть
- •2.1 Используемые материалы:
- •2.2 Методики получения сорбента и исследования
- •2.2.1 Получение рмм (FeIii) сорбента
- •2.2.2 Определение удельной поверхности сорбента
- •2.2.3 Определение сорбционной емкости сорбента
- •2.2.3.1 Проведение металл-аффинного анализа
- •2.2.3.2 Определение влажности рмм Fe(III) сорбента
- •2.2.3.3 Определение влажности коммерческого сорбента
- •2.2.4 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •2.2.4.1 Выделение суммарного белка из обезжиренного сухого молока
- •2.2.4.2 Гидролиз суммарного белка молока коровы в присутствии трипсина
- •2.2.5 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •2.2.5.1 Гидролиз сывороточного альбумина человека в присутствии пепсина
- •2.2.6 Масс-спектрометрический анализ
- •2.2.6.1 Масс-спектрометрический анализ методом maldi-tof и maldi-tof-tof
- •2.2.6.2 Обработка данных масс-спектрометрического анализа
- •3. Экспериментальная часть
- •3.1. Получение рмм Fe(III) сорбента
- •3.2 Определение удельной поверхности
- •3.3 Определение электрокинетического потенциала и размера частиц.
- •3.4 Определение сорбционной емкости сорбента
- •3.4.1Проведение металл-аффинного анализа
- •3.4.2 Определение содержание пептида в проскоке и контрольном образце
- •3.4.3 Определение влажности коммерческого сорбента и рммс Fe(III)
- •3.5 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •3.5.1 Приготовление микроколонки с сорбентом
- •3.5.2 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.5.3 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.6 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •3.6.1 Приготовление металл-аффинной колонки
- •3.6.2 Выбор элюэнта
- •3.6.3 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.6.4 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.7 Масс-спектрометрический анализ
- •3.7.1 Проведение масс-спектрометрического анализа
- •4 Обсуждение результатов эксперимента
- •4.1 Охарактеризация сорбента
- •4.1.1. Получение рмм сорбента, содержащего ионы железа (III) и приготовление хроматографических колонок.
- •4.1.2 Определение удельной поверхности
- •4.1.3 Определение емкости сорбента
- •4.1.4 Микроэлектрофоретические исследования.
- •4.1.4.1 Определение электрокинетического потенциала
- •4.1.4.2 Расчет удельной поверхности рмм сорбента
- •4.2 Исследование возможности специфичного выделения фосфорилированных пептидов из биологического образца методом металл-аффинной хроматографии с использованием рммс(Fe III)
- •4.3 Разработка метода металл-аффинного выделения прямых ковалентных аддуктов зомана с сывороточным альбумином с помощью рмм сорбентов Fe(III) для последующего масс-спектрометрического анализа
- •4.3.1 Поиск и идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с зоманом
- •4.3.2 Выделение фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека с использованием рммс (Fe III)
- •4.3.2 Масс-спектрометрическая идентификация сайтов связывания зомана с альбумином при взаимодействии с белками in vitro
- •Выводы по работе:
- •Список использованных источников.
- •Приложение а Технико-экономическая оценка научно-исследовательской работы Обоснование договорной цены на разработку
- •Расчет затрат на научно-исследовательскую разработку
- •Расчет затрат на сырье, материалы, реактивы, покупные изделия и полуфабрикаты
- •Расчет затрат на энергоресурсы
- •Расчет затрат на приборы, оборудование для научно-экспериментальных работ и суммы амортизационных отчислений
- •Расчет затрат на оплату труда с обязательными начислениями
- •Прочие затраты Расчет суммы расходов по использованию вычислительной техники.
- •Затраты на выполнение специальных анализов.
- •Расчет суммы накладных расходов
- •Расчет сметы затрат на разработку
- •Приложение б Охрана труда и окружающей среды
- •1 Опасные и вредные производственные факторы
- •2 Пожарная безопасность
- •3 Обеспечение санитарно-гигиенических условий
- •4 Вентиляция
- •5 Аптечка и ее содержание
- •6 Освещение помещения
- •7 Безопасность выполнения работы в лаборатории
- •8 Анализ технологических операций
- •9 Меры первой помощи
- •Охрана окружающей среды
- •Приложение в
- •Приложение г Масс-спектры смеси триптических пептидов казеина, элюированных с колонки с сорбентом, содержащим ионы железа.
1.3 Методы характеризации сорбентов
1.3.1 Удельная поверхность
От величины удельной поверхности зависят поглотительная способность адсорбентов, эффективность твёрдых катализаторов, свойства фильтрующих материалов. Как правило, для эффективной адсорбции твёрдые адсорбенты должны обладать высокими значениями удельной поверхности, например Sуд активных углей составляет 500—1500, силикагелей — до 800, макропористых ионообменных смол — не более 70, а диатомитовых носителей для газожидкостной хроматографии — менее 10 м2/г.
Распространенный метод определения – метод термической десорбции. Он основан на прямой зависимости между расходом стандартного газа, поглощенного при низкой температуре образцом адсорбента из потока газа-носителя, и удельной поверхностью. Сущность метода заключается в том, что из смеси адсорбата с газом-носителем (гелием) происходит поглощение адсорбата при охлаждении образца адсорбента до температуры жидкого азота, что регистрируется на хроматограмме в виде адсорбционного пика. После установления равновесия и размораживания образца по площади десорбционного пика, как менее размытого, судят о величине удельной поверхности.
Метод имеет ряд преимуществ: позволяет исследовать образцы, чувствительные к высоким температурам; обладает высокой чувствительностью; обеспечивает широкий диапазон ((0,01-1000) м2/г) измерения удельных поверхностей при использовании одного адсорбата [13].
1.3.2 Емкость сорбента, влажность
При проведении экспериментов, обычно исходят из единицы массы сухого сорбента или объема, который занимает единица массы сухого сорбента. Для этого определяют влажность образца и в дальнейшем при расчетах, например, при определении емкостных характеристик, это значение вычитают. Емкость сорбента – важнейшая его характеристика, количественная мера его способности поглощать частицы из раствора или газа. Различают также общую или полную емкость и рабочую емкость (емкость до проскока), которая зависит от ряда условий: рН раствора, величины зерна, размеров поглощаемых молекул или ионов. Емкость сорбента определяют по величине сорбции весовым методом (по изменению массы сорбента), статическим методом (по изменению концентрации раствора до и после проведения сорбции) [14].
1.3.3 Электрокинетический потенциал
Для новых видов адсорбентов для металл-аффинной хроматографии необходимо изучить поверхностные свойства созданных частиц. Одним из параметров, характеризующих электрические и структурные свойства поверхности, является электрокинетический потенциал – ξ-потенциал – причиной которого является существование двойного электрического слоя (ДЭС). Действительно, разноименность зарядов фаз приводит в случае неподвижного пористого тела в электрическом поле к перемещению подвижных противоионов вместе с жидкой фазой к соответствующему полюсу (одноименного с твердой фазой знака). Действие же внешней механической силы (давление) вызывает вынос подвижного заряда диффузного слоя и, следовательно, возникновение разности потенциалов.
Ранее было показано [15] близкое совпадение данных зависимости электрокинетического потенциала от рН для различных по способу образования поверхностей. Таким образом, значения ξ-потенциала дают возможность говорить о составе и координации групп, входящих в соединение.