1.2.1 Металл-аффинная хроматография – сочетание принципов лигандообменной и аффинной хроматографии

Современным методом хроматографического разделения и получения образца, обогащенного фосфорилированными пептидами, является металл-аффинная хроматография. В основе этого хроматографического метода лежит различное сродство белков к ионам некоторых металлов. Образование комплекса иона металла и некоторых аминокислотных остатков или модификаций (например, фосфатных групп), находящихся на поверхности молекулы белка, легко обратимо. Следовательно, иммобилизованные ионы металлов можно использовать как сорбент, причем разрушить комплекс можно в мягких денатурирующих условиях. Взаимодействие с белками и пептидами строго pH-зависимое, поэтому связанные пептиды можно элюировать, изменяя рН, уменьшая ионную силу буфера или используя другие хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или имидазол.

Ионы металлов чаще всего классифицируются согласно теории ЖМКО Пирсона [10]. Жесткие ионы (Fe³⁺, Ca²⁺, Al³⁺) легче всего координируются к кислороду, мягкие ионы (Cu⁺, Hg⁺, Ag⁺) - к сере. Промежуточные по жесткости ионы (Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Co²⁺) - к азоту, кислороду и сере. "Мишенями" жестких ионов могут являться такие аминокислоты как тирозин или фосфорилированные серин, треонин или тирозин. Селективность жестких и промежуточных ионов различна [10]: при оптимальном для их связывания рН (кислом и нейтральном соответственно), они координируются с разными аминокислотными остатками или модификациями на поверхности молекулы белка. Такое различие способствует селективному разделению, становится возможным одношаговое выделение белков из сложных биологических смесей.

Принцип металл-аффинной хроматографии (МАХ) впервые был сформулирован в работе Пората в 1975 году [11]. Он был основан на известном сродстве ионов переходных металлов, таких как Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Co²⁺ к аминокислотам гистидину и цистеину в водных растворах. Так появилась идея использовать "зафиксированные" ионы металлов для фракционирования растворов пептидов. В качестве хелатирующего лиганда, "фиксирующего" на подложке ион металла, была использована иминодиуксусная кислота (iminodiacetic acid (IDA), рисунок 1.2.1.1), которая и по сей день применяется во многих коммерческих решениях по металл-аффинной хроматографии.

Рисунок 1.2.1.1 - Иминодиуксусная кислота (IDA)

Сила связи ион металла – хелатирующий лиганд зависит от следующих факторов [12]:

• электростатическое взаимодействие, определяется зарядом и ионным радиусом;

• сродство иона металла к электронам;

• электронная конфигурация иона металла.

Механизм координирования иона металла к белку можно продемонстрировать на примере Fe³⁺, иммобилизованного на IDA, и фосфатных групп на поверхности белка (рисунок 1.2.1.2) [12].

Рисунок 1.2.1.2 - Образование четырехчленного цикла при взаимодействии IDA-Fe³⁺ и фосфатной группы

Связывание фосфатных групп с иммобилизованными Fe³⁺ является результатом не только электростатических взаимодействий, но и химических, поскольку, к примеру, отрицательно заряженные нуклеотиды, циклические мононуклеотиды и динуклеотиды не связываются с IDA-Fe³⁺, и сила связи с нуклеотидом не зависит от количества фосфатных групп. Высокое сродство фосфатных групп к Fe³⁺ можно частично объяснить тем, что образуется две координационных связи иона металла с фосфатной группой и лишь одна – с карбоксильной группой.

В протеомике металл-аффинную хроматографию применяют для обогащения пептидных смесей некоторыми типами пептидов (например, фосфорсодержащими или металлсодержащими) для последующего масс-спектрометрического анализа. Наибольшее распространение получило обогащение фосфорилированных белков и пептидов с помощью иммобилизованных Fe³⁺, Ga³⁺ и других ионов. Последние исследования показывают, что обогащение можно проводить с высокой селективностью и на Al³⁺, Zr⁴⁺, Ti⁴⁺. Основными сайтами фосфорилирования являются серин (90% модификаций), треонин (10%), тирозин (0.1%).