
- •Содержание
- •1 Аналитический обзор 11
- •2 Методическая часть 29
- •3. Экспериментальная часть 37
- •4 Обсуждение результатов эксперимента 44
- •Условные обозначения
- •Введение
- •1 Аналитический обзор
- •1.1 Регулярные мультимолекулярные структуры
- •1.2 Хроматография
- •1.2.1 Металл-аффинная хроматография – сочетание принципов лигандообменной и аффинной хроматографии
- •1.3 Методы характеризации сорбентов
- •1.3.1 Удельная поверхность
- •1.3.2 Емкость сорбента, влажность
- •1.3.3 Электрокинетический потенциал
- •1.4 Maldi масс-спектрометрия
- •1.5 Идентификация белков – метод pmf
- •1.6 Тандемная масс-спектрометрия (мс-мс) и идентификация пептиов по фрагментным масс-спектрам
- •1.7 Идентификация пост-трансляционных модификаций
- •1.8 Аддукты зомана с сывороточным альбумином
- •2 Методическая часть
- •2.1 Используемые материалы:
- •2.2 Методики получения сорбента и исследования
- •2.2.1 Получение рмм (FeIii) сорбента
- •2.2.2 Определение удельной поверхности сорбента
- •2.2.3 Определение сорбционной емкости сорбента
- •2.2.3.1 Проведение металл-аффинного анализа
- •2.2.3.2 Определение влажности рмм Fe(III) сорбента
- •2.2.3.3 Определение влажности коммерческого сорбента
- •2.2.4 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •2.2.4.1 Выделение суммарного белка из обезжиренного сухого молока
- •2.2.4.2 Гидролиз суммарного белка молока коровы в присутствии трипсина
- •2.2.5 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •2.2.5.1 Гидролиз сывороточного альбумина человека в присутствии пепсина
- •2.2.6 Масс-спектрометрический анализ
- •2.2.6.1 Масс-спектрометрический анализ методом maldi-tof и maldi-tof-tof
- •2.2.6.2 Обработка данных масс-спектрометрического анализа
- •3. Экспериментальная часть
- •3.1. Получение рмм Fe(III) сорбента
- •3.2 Определение удельной поверхности
- •3.3 Определение электрокинетического потенциала и размера частиц.
- •3.4 Определение сорбционной емкости сорбента
- •3.4.1Проведение металл-аффинного анализа
- •3.4.2 Определение содержание пептида в проскоке и контрольном образце
- •3.4.3 Определение влажности коммерческого сорбента и рммс Fe(III)
- •3.5 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •3.5.1 Приготовление микроколонки с сорбентом
- •3.5.2 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.5.3 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.6 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •3.6.1 Приготовление металл-аффинной колонки
- •3.6.2 Выбор элюэнта
- •3.6.3 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.6.4 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.7 Масс-спектрометрический анализ
- •3.7.1 Проведение масс-спектрометрического анализа
- •4 Обсуждение результатов эксперимента
- •4.1 Охарактеризация сорбента
- •4.1.1. Получение рмм сорбента, содержащего ионы железа (III) и приготовление хроматографических колонок.
- •4.1.2 Определение удельной поверхности
- •4.1.3 Определение емкости сорбента
- •4.1.4 Микроэлектрофоретические исследования.
- •4.1.4.1 Определение электрокинетического потенциала
- •4.1.4.2 Расчет удельной поверхности рмм сорбента
- •4.2 Исследование возможности специфичного выделения фосфорилированных пептидов из биологического образца методом металл-аффинной хроматографии с использованием рммс(Fe III)
- •4.3 Разработка метода металл-аффинного выделения прямых ковалентных аддуктов зомана с сывороточным альбумином с помощью рмм сорбентов Fe(III) для последующего масс-спектрометрического анализа
- •4.3.1 Поиск и идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с зоманом
- •4.3.2 Выделение фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека с использованием рммс (Fe III)
- •4.3.2 Масс-спектрометрическая идентификация сайтов связывания зомана с альбумином при взаимодействии с белками in vitro
- •Выводы по работе:
- •Список использованных источников.
- •Приложение а Технико-экономическая оценка научно-исследовательской работы Обоснование договорной цены на разработку
- •Расчет затрат на научно-исследовательскую разработку
- •Расчет затрат на сырье, материалы, реактивы, покупные изделия и полуфабрикаты
- •Расчет затрат на энергоресурсы
- •Расчет затрат на приборы, оборудование для научно-экспериментальных работ и суммы амортизационных отчислений
- •Расчет затрат на оплату труда с обязательными начислениями
- •Прочие затраты Расчет суммы расходов по использованию вычислительной техники.
- •Затраты на выполнение специальных анализов.
- •Расчет суммы накладных расходов
- •Расчет сметы затрат на разработку
- •Приложение б Охрана труда и окружающей среды
- •1 Опасные и вредные производственные факторы
- •2 Пожарная безопасность
- •3 Обеспечение санитарно-гигиенических условий
- •4 Вентиляция
- •5 Аптечка и ее содержание
- •6 Освещение помещения
- •7 Безопасность выполнения работы в лаборатории
- •8 Анализ технологических операций
- •9 Меры первой помощи
- •Охрана окружающей среды
- •Приложение в
- •Приложение г Масс-спектры смеси триптических пептидов казеина, элюированных с колонки с сорбентом, содержащим ионы железа.
3 Обеспечение санитарно-гигиенических условий
Для обеспечения нормальных санитарно-гигиенических условий при работе в лаборатории выдвигается ряд требований к системам вентиляции, воздушному отоплению, влажности и освещенности, а также к шумовым характеристикам помещения. Лаборатория, в которой проводилась работа, соответствует следующим параметрам:
-
температура воздуха в помещении (18-25)°С;
-
относительная влажность в помещении не более 60 отн. доли %;
-
скорость движения воздуха не более 0,2 м/с;
-
уровень шума не превышает 60 дБ.
Концентрации паров вредных веществ в воздухе не превышает ПДКр.з.
4 Вентиляция
Обеспечение нормальных метеорологических условий и чистоты воздуха на рабочих местах в значительной степени зависит от правильно организованной системы вентиляции [46]. В лаборатории имеется два вида вентиляции: приточно-вытяжная общеобменная механическая и местная вентиляция, предназначенная для улавливания загрязнений непосредственно у мест их выделения и предотвращения их перемешивания с воздухом помещения. Воздух, удаляемый вытяжной вентиляцией, в объеме 90 % (отн. доли) компенсируется притоком свежего воздуха от специальной центральной системы кондиционирования, размещенной в техническом блоке; 10 % (отн. доли) приточного воздуха попадает в коридор. Для защиты работающих от соприкосновения с газами и парами вредных веществ часть промежуточных операций выполняются в вытяжных шкафах. Для предотвращения распространения паров вредных веществ вытяжные шкафы оборудованы вентиляционной системой отсоса, также специальными защитными шторками. Скорость движения воздуха в рабочем проеме шкафа (0,75-1,0) м/с, кратность воздухообмена 3.
Вентиляционная система размещается в специальном помещении на техническом этаже здания. На случай возникновения пожара предусмотрена возможность немедленного отключения вентиляционных систем. Такое отключение производится с помощью кнопок, расположенных непосредственно у лабораторных шкафов. Поскольку помещение лаборатории относится к пожароопасным, то оборудование вентиляционной системы выполнено из материалов, не вызывающих искрообразования, и имеет заземление.
-
-
5 Аптечка и ее содержание
Работа в лаборатории связана с опасностью, так как работающие имеют дело с химическими реактивами, повышенной температурой поверхности оборудования, стеклянной посудой и другими явлениями, которые могут стать причиной различного рода травм. На этот случай в помещении лаборатории обязательно должна находиться аптечка, в которую входит определенный набор медикаментов.
В медицинской аптечке находятся: перекись водорода, раствор соды 2%, нашатырный спирт, спиртовой раствор йода, вата, бинт, жгут, анальгин, парацетамол, валидол.
6 Освещение помещения
В лаборатории осуществляется естественное боковое (через оконные проемы в наружных стенах) и комбинированное искусственное освещение. Общее искусственное освещение выполняется за счет равномерно расположенных в верхней зоне лаборатории люминесцентных ламп, обладающих пониженной пожароопасностью и высокой световой отдачей. Прямое попадание света в глаза возникновение теней, неравномерность распределения света исключены [47].
Основные показатели по освещенности приведены в таблице Б.3.
Таблица Б.3 - Нормы освещения лабораторного помещения
Характеристика зрительной работы |
Разряд зритель ной работы |
Плоскость нормированной рабочей поверхности |
Искусственное комбинированное освещение |
Естеств. боковое освещени |
|||
Освещенность, лк |
Сочетание нормируемых величин показателя ослепленности и коэффициента пульсации |
||||||
всего |
в т. ч. общего |
Р |
к,% |
Коэффиц. естеств. освещенности (КЕО), ен, % |
|||
Средняя точность |
IV в |
Г-08 |
400 |
200 |
40 |
20 |
1,5 |