
- •Содержание
- •1 Аналитический обзор 11
- •2 Методическая часть 29
- •3. Экспериментальная часть 37
- •4 Обсуждение результатов эксперимента 44
- •Условные обозначения
- •Введение
- •1 Аналитический обзор
- •1.1 Регулярные мультимолекулярные структуры
- •1.2 Хроматография
- •1.2.1 Металл-аффинная хроматография – сочетание принципов лигандообменной и аффинной хроматографии
- •1.3 Методы характеризации сорбентов
- •1.3.1 Удельная поверхность
- •1.3.2 Емкость сорбента, влажность
- •1.3.3 Электрокинетический потенциал
- •1.4 Maldi масс-спектрометрия
- •1.5 Идентификация белков – метод pmf
- •1.6 Тандемная масс-спектрометрия (мс-мс) и идентификация пептиов по фрагментным масс-спектрам
- •1.7 Идентификация пост-трансляционных модификаций
- •1.8 Аддукты зомана с сывороточным альбумином
- •2 Методическая часть
- •2.1 Используемые материалы:
- •2.2 Методики получения сорбента и исследования
- •2.2.1 Получение рмм (FeIii) сорбента
- •2.2.2 Определение удельной поверхности сорбента
- •2.2.3 Определение сорбционной емкости сорбента
- •2.2.3.1 Проведение металл-аффинного анализа
- •2.2.3.2 Определение влажности рмм Fe(III) сорбента
- •2.2.3.3 Определение влажности коммерческого сорбента
- •2.2.4 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •2.2.4.1 Выделение суммарного белка из обезжиренного сухого молока
- •2.2.4.2 Гидролиз суммарного белка молока коровы в присутствии трипсина
- •2.2.5 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •2.2.5.1 Гидролиз сывороточного альбумина человека в присутствии пепсина
- •2.2.6 Масс-спектрометрический анализ
- •2.2.6.1 Масс-спектрометрический анализ методом maldi-tof и maldi-tof-tof
- •2.2.6.2 Обработка данных масс-спектрометрического анализа
- •3. Экспериментальная часть
- •3.1. Получение рмм Fe(III) сорбента
- •3.2 Определение удельной поверхности
- •3.3 Определение электрокинетического потенциала и размера частиц.
- •3.4 Определение сорбционной емкости сорбента
- •3.4.1Проведение металл-аффинного анализа
- •3.4.2 Определение содержание пептида в проскоке и контрольном образце
- •3.4.3 Определение влажности коммерческого сорбента и рммс Fe(III)
- •3.5 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •3.5.1 Приготовление микроколонки с сорбентом
- •3.5.2 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.5.3 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.6 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •3.6.1 Приготовление металл-аффинной колонки
- •3.6.2 Выбор элюэнта
- •3.6.3 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.6.4 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.7 Масс-спектрометрический анализ
- •3.7.1 Проведение масс-спектрометрического анализа
- •4 Обсуждение результатов эксперимента
- •4.1 Охарактеризация сорбента
- •4.1.1. Получение рмм сорбента, содержащего ионы железа (III) и приготовление хроматографических колонок.
- •4.1.2 Определение удельной поверхности
- •4.1.3 Определение емкости сорбента
- •4.1.4 Микроэлектрофоретические исследования.
- •4.1.4.1 Определение электрокинетического потенциала
- •4.1.4.2 Расчет удельной поверхности рмм сорбента
- •4.2 Исследование возможности специфичного выделения фосфорилированных пептидов из биологического образца методом металл-аффинной хроматографии с использованием рммс(Fe III)
- •4.3 Разработка метода металл-аффинного выделения прямых ковалентных аддуктов зомана с сывороточным альбумином с помощью рмм сорбентов Fe(III) для последующего масс-спектрометрического анализа
- •4.3.1 Поиск и идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с зоманом
- •4.3.2 Выделение фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека с использованием рммс (Fe III)
- •4.3.2 Масс-спектрометрическая идентификация сайтов связывания зомана с альбумином при взаимодействии с белками in vitro
- •Выводы по работе:
- •Список использованных источников.
- •Приложение а Технико-экономическая оценка научно-исследовательской работы Обоснование договорной цены на разработку
- •Расчет затрат на научно-исследовательскую разработку
- •Расчет затрат на сырье, материалы, реактивы, покупные изделия и полуфабрикаты
- •Расчет затрат на энергоресурсы
- •Расчет затрат на приборы, оборудование для научно-экспериментальных работ и суммы амортизационных отчислений
- •Расчет затрат на оплату труда с обязательными начислениями
- •Прочие затраты Расчет суммы расходов по использованию вычислительной техники.
- •Затраты на выполнение специальных анализов.
- •Расчет суммы накладных расходов
- •Расчет сметы затрат на разработку
- •Приложение б Охрана труда и окружающей среды
- •1 Опасные и вредные производственные факторы
- •2 Пожарная безопасность
- •3 Обеспечение санитарно-гигиенических условий
- •4 Вентиляция
- •5 Аптечка и ее содержание
- •6 Освещение помещения
- •7 Безопасность выполнения работы в лаборатории
- •8 Анализ технологических операций
- •9 Меры первой помощи
- •Охрана окружающей среды
- •Приложение в
- •Приложение г Масс-спектры смеси триптических пептидов казеина, элюированных с колонки с сорбентом, содержащим ионы железа.
-
Приложение б Охрана труда и окружающей среды
Работа проводилась в лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии ИАнП РАН. В данной работе проводилось получение и исследование свойств мультимолекулярных сорбентов на основе регулярных структур, содержащих ионы железа (III), а так же обогащение на них образцов, модифицированных ФОС содержащим остатком.
Проведение исследовательской работы можно представить в виде следующих этапов:
-
Получение и оценка свойств сорбента.
-
Применение его в качестве сорбента для металл-аффинной хроматографии.
-
Масс-спектрометрическое исследование полученных образцов.
1 Опасные и вредные производственные факторы
Опасные и вредные производственные факторы разделяются по природе действия на группы: физические, химические, биологические и психофизиологические. В лаборатории основное влияние оказывают физические и химические факторы.
Физический фактор - шум, электрический ток, вибрация и другие. Химический фактор - вредное воздействие на организм человека различного сырья, отходов. Группа физических факторов - это повышенная или пониженная температура поверхностей оборудования, материалов, повышенные уровни шума, вибраций движущихся частей машин, электромагнитное излучение, неудовлетворительное освещение, электрический ток и т.п. [38]
Шум - совокупность звуков различной частоты и интенсивности, возникающих в результате колебательного движения в упругих средах. В результате длительного воздействия нарушается деятельность сердечнососудистой и нервной систем, пищеварительных и кроветворных органов, развивается профессиональная тугоухость. Уровень шума не должен превышать 60 дБ [39,40].
Вибрация - колебание твердых тел - частей аппаратов, машин, оборудования, воспринимаемые организмом человека как сотрясения. Вибрации действуют на ЦНС, желудочно-кишечный тракт, органы равновесия, вызывают головокружение, заболевания суставов. [41]
Электрический ток. При работе с электрооборудованием могут возникнуть электротравмы, внешними проявлениями которой могут быть ожоги, металлизация поверхности кожи человека. Путь прохождения тока через тело человека играет существенную роль в исходе поражения, т.к. ток может пройти через жизненно важные органы: сердце, легкие, головной мозг и др. Такие электротравмы приводят к летальному исходу.
Группа химических опасных и вредных факторов связана с вредным воздействием на организм человека различных химических веществ и их соединений. Сведения о химических факторах представлены в таблице Б.1. [43,44,52].
Психофизиологические опасные и вредные факторы по характеру действия подразделяются на физические (статические и динамические) и нервно-психические нагрузки (умственное напряжение, перенапряжение анализаторов, монотонность труда), эмоциональные перегрузки. Данные воздействия необходимо учитывать, так как они играют немаловажную роль в процессе труда.
Таблица Б.1 - Характеристика физико-химических, пожаровзрывоопасных и токсичных свойств используемых реактивов
Вещества |
Физико-химические свойства [52] |
Пожаровзрывоопасные свойства [43] |
Токсические свойства [44] |
|||||||||
Агрегатное состояние |
Температура кипения, °С |
Температура плав- ления,°С |
Плотность, кг/м3 |
Температура, °С |
Пределы распространения пламени |
Класс опас-ности |
ПДКр.з.мг/м3 |
|||||
Вспышки |
Самовоспла-менения |
Температурные, °С |
Концентрац. г/м3 |
|||||||||
Нижний |
Верхний |
Нижний |
Верхний |
|||||||||
Аммиака раствор 10% |
ж |
-33.34 |
-77,7 |
0,7714 |
- |
650 |
|
|
15 |
28 |
4 |
20 |
Гексан |
ж |
69 |
-95 |
0,6548 |
-22 |
240 |
|
|
|
|
4 |
900/300 |
Ацетонитрил |
ж. |
82 |
-45 |
0,786 |
2 |
>450 |
3 |
|
|
|
3 |
10 |
Триэтиламин |
ж. |
89 |
-155 |
0,7 |
-17 |
230 |
|
|
|
|
|
|
Трифторуксусная кислота |
ж. |
72,4 |
-15,3 |
1,49 |
|
|
|
|
|
|
3 |
2 |
Уксусная кислота |
ж. |
117,8 |
16,64 |
1,05 |
38 |
454 |
35 |
76 |
|
|
3 |
5 |
Ацетон |
ж |
56 |
-95 |
0,7899 |
-18 |
540 |
-20 |
6 |
|
|
3 |
200 |
Пиперидин |
ж |
106 |
-7 |
0,862 |
16 |
|
|
|
|
|
1 |
0,2 |
Едкий натр NaOH |
ж |
1403 |
323 |
1,829 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
2 |
0,5 |
Диметилсульфоксид |
ж |
189 |
18 |
1,101 |
87 |
244 |
84 |
- |
|
- |
4 |
20 |
Диметилформамид |
ж |
153 |
-61 |
0,9445 |
53 |
440 |
50 |
85 |
|
|
2 |
10 |
Если в графе "Величина ПДК" приведено два норматива, то это означает, что в числителе максимальная разовая, а в знаменателе - среднесменная ПДК