4.3.2 Масс-спектрометрическая идентификация сайтов связывания зомана с альбумином при взаимодействии с белками in vitro
На втором этапе исследования по той же схеме были проанализированы образцы, полученные в эксперименте in vitro.
Образцы, использованные для дальнейшего проведения эксперимента in vitro, содержали сывороточный альбумин, выделенный из донорской плазмы после ее инкубации с зоманом в концентрациях 0.1 мг/мл, 10-3 мг/мл,10-5 мг/мл, 10-6 мг/мл. Пробоподготовку проводили по процедуре, описанной выше (в качестве колонки использовали спиновую колонку, содержащей 15 монослоев сорбента, наносили 500 мкл образца) полученные масс-спектры представлены на рисунке 4.3.2.1.
Рисунок 4.3.2.1 – Масс-спектры пепсиновых гидролизатов альбумина человека, модифицированного зоманом в различных концентрациях, полученных при инкубации плазмы крови человека в эксперименте in vitro: 1 – GD 0.1мг/мл, 2 – GD 10-3мг/мл, 3 – GD 10-5 мг/мл, 4 – GD 10-6мг/мл
Результаты анализа пептического гидролизата методом металл-аффинной хроматографии представлены на рисунке 4.3.2.2.
А – концентрация зомана (CGD) 0.1мг/мл, Б - CGD 10-3мг/мл, В - CGD 10-5мг/мл, Г - CGD 10-6 мг/мл
Рисунок 4.3.2.2 – Масс-спектры пепсиновых гидролизатов альбумина человека, выделенного из плазмы крови человека, модифицированной зоманом после элюции с металл-аффинного сорбента, содержащего Fe (III), 0,5% раствором NEt3. в Н2O
Как показано на рисунке, во всех масс-спектрах надежно детектируется сигнал m/z 1568 Да. Причем ни на одном масс-спектре не были обнаружены сигналы других ранее описанных аддуктов, что позволяет сделать вывод, что в эксперименте in vitro модификация альбумина прошла только по одному сайту.
Таким образом, в результате работы показано, что при применении РММС Fe(III) В качестве металл-аффинного сорбента позволяет успешно обогащать биологический образец фосфонилированными пептидами.
-
Выводы по работе:
1 Разработан новый металл-аффинный сорбент РММС (FeIII) для специфичного выделения фосфорсодержащих пептидов из биологических образцов. Впервые в качестве сорбента использованы регулярные мультимолекулярные структуры, полученные по методу Лэнгмюра-Блоджетт.
2 Определены основные характеристики РММС (FeIII):
а) сорбционная емкость – 65 мкмоль на 100 мг (влажного сорбента), или 185 мкмоль на 100 мг (сухого сорбента);
б) величина удельной поверхности ~ 4 м2/г;
в) показана зависимость заряда поверхности от значений рН. При значениях рН=3,5 отсутствует специфическая сорбция на поверхности ММС.
3 Показана возможность специфичного выделения фосфорилированных пептидов из суммарного белка молока коровы при использовании металл-аффинного сорбента РММС (FeIII).
4 Разработана методика обогащения биологических образцов пептидами сывороточного альбумина человека, модифицированных остатком зомана.
а) Обнаружены и описаны новые, модифицированные остатком зомана, пептиды сывороточного альбумина человека (MH+1568,84 Да VKHKPKATKEQL(GD), MH+1680,79 Да HTLFGDKLCTVATL(GD)).
б) Впервые проведено выделение аддуктов сывороточного альбумина с зоманом методом металл-аффинной хроматографии с последующим масс-спектрометрическим детектированием.