4.3.2 Выделение фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека с использованием рммс (Fe III)

Для отработки методов металл-аффинных хроматографии нами были использованы те же образцы гидролизата сывороточного альбумина человека, модифицированного зоманом что и в предыдущей стадии эксперимента. Первичную отработку метода проводили на гидролизате сывороточного альбумина человека с концентрацией зомана при инкубировании 10^-3 мг/мл, поскольку в этом образце один из аддуктов уверено детектируется (1568 Да), а второй (1680 Да) уже нет и присутствует сигнал 1992 Да, который, не смотря на массу, близкую к массе аддукта, включающего в себя тирозин-411, на основании полученного фрагментного масс-спектра нами был отнесен к ложноположительным на предыдущей стадии исследования (рисунок 4.3.1.4). Анализ проводили в спиновой колонке, содержащей 10 монослоев сорбента, объем образца составлял 100 мкл (20 мкл раствора гидролизата доводили до 100 мкл 0,1%-м раствором ТФУ). По общепринятой методике элюцию проводили 5%-м раствором аммиака, однако, в проскоке с колонки исследуемые пептиды обнаружены не были, так же как не были найдены и в элюате. На основании этого был сделан вывод, что донорной силы азота, входящего в состав молекулы аммиака не достаточно для успешной десорбции фосфонилированных пептидов. Поэтому возникла необходимость в дополнительном эксперименте по подбору подходящего элюента.

В качестве элюентов были опробованы 0,5%-й NaOH, триэтиламин, водный гидразин, тетраметилгидроксид аммония, диметилсульфоксид, диметилформамид, ацетонитрил. Эксперимент показал, что, интересующие нас пептиды элюируются только 0,5%-м триэтиламином (рисунок 4.3.2.1 А), причем, для нанесения образца на мишень необходимо либо избыточное количество матрицы, либо предварительное обессоливание образца. Тем не менее, было принято решение использовать именно этот элюент, поскольку только при его использовании искомые аддукты были успешно детектированы масс-спектрометрически.

А. Масс-спектр образца, полученного элюцией 0,5% триэтиламином. Б Масс-спектр образца, полученного элюцией 100% ацетонитрилом. В Масс-спектр образца, полученного элюцией 5% гидроксидом аммония. Г Масс-спектр образца, полученного элюцией 0,1 М бикарбонатным буфером. Д. Масс-спектр не связавшейся с колонкой частью образца

Рисунок 4.3.2.1 – Результаты масс-спектрометрического анализа элюатов с металл-аффинного сорбента, содержащего Fe (III)

Стоит отметить, что пептид с m/z 1992,8 Да элюируется с колонки уже бикарбонатом аммония (рисунок 4.5.1 Г), что для пептидов, модифицированных остатком ФОС не характерно, что подтверждает правомерность отнесения сигнала к ложноположительным.

Однако, что такая концентрация зомана в образце (10^-3 мг/мл) превышает летальную, поэтому следующим этапом была отработка метода обогащения образца фосфонилированными аддуктами. Для решения этой задачи увеличили объем образца, взятого для анализа и, соответственно, увеличили объем сорбента. Анализ проводили на спиновых колонках, с помощью которых можно инкубировать 0,5 мл образца с достаточным для анализа количеством сорбента (15 монослоев). При анализе методом MALDI-TOF для нанесения на мишень требуется примерно 0,5 мкл раствора, поэтому представлялось возможным сконцентрировать искомые аддукты на два порядка для их успешного определения указанным методом.

Для того чтобы сократить время, требуемое для анализа, были пропущены некоторые стадии элюции, такие как: промывка кислотой, водой, бикарбонатом и ацетонитрилом, поскольку этими элюентами аддукты не элюируются. Была оставлена стадия элюции раствором аммиака, поскольку этот раствор элюирует значительное количество пептидов альбумина с сорбента. Таким образом, для обогащения образца методику металл-аффинной хроматографии сократили до трех стадий:

1 Сорбция при рН = 3.

2 Промывка 10%-ым NH₃ в H₂O.

3 Элюция 0.5%-ым NEt₃ в H₂O.

После проведения процедуры обогащения со всеми изменениями, описываемыми выше, элюат 0.5% NEt₃ после высушивания и перерастворения в 0,1% ТФУ был нанесен на мишень (по методу с использованием микроколонок с сорбентом С18, поскольку даже при высушивании в вакуумной центрифуге триэтиламин полностью не удаляется и при смешении с матрицей на мишени образует карамелизованную смесь вместо кристаллов, что не позволяет эффективно проводить масс-спектрометрический анализ) и проанализирован масс-спектрометрически. Для повышения чувствительности масс-спектр получали в линейном режиме, с отсечкой по массам 1300 Да. Результат представлен на рисунке 4.3.2.2.

Рисунок 4.3.2.2 – Масс-спектр элюата NEt3 с металл-аффинной колонки, содержащий сорбент Fe(III) образца, полученного в результате инкубации сывороточного альбумина человека с зоманом в концентрации 10^-5 мг/мл

Таким образом, обогащение образца с концентрацией зомана 10^-5 мг/мл фосфонилированными аддуктами прошло успешно. Оба пептида, идентифицированных как аддукты, были масс-спектрометрически детектированы. Следующей стадией исследования была попытка выделить аддукты из образца с концентрацией зомана 10^-7 мг/мл. Исследование проводили по той же схеме, но с увеличением объема раствора до 1000 мкл и, соответственно, использовали колонку представленную на рисунке 4.1.1.3, содержащий 35 монослоев. Масс-спектры получали также в линейном режиме, с отсечкой по массам 1300 Да.

Результаты представлены на рисунке 4.3.2.3. Как показано на рисунке, пептид с m/z 1680 Да обнаружен не был, в то время как пептид с m/z 1568 Да достаточно надежно в масс-спектре детектируется. Несмотря на низкое содержание аддукта, была предпринята попытка провести MS/MS анализ пептида, и по его результатам сделан вывод, что в образец содержит действительно аддукт зомана с пептидом альбумина человека (рисунок 4.3.2.4). На фрагментном масс-спектре достоверно видны сигналы, соответствующие отщеплению остатка зомана от пептида.

Рисунок 4.3.2.3 – Масс-спектр элюата NEt₃ с металл-аффинной колонки, содержащий сорбент Fe(III) образца, полученного в результате инкубации сывороточного альбумина человека с зоманом в концентрации 10^-7 мг/мл

.

Рисунок 4.3.2.4 – Фрагментный масс-спектр пептида VKHKPKATKEQL(GD)

Таким образом, в результате работы было показано, что при помощи металл-аффинных сорбентов можно не только специфично выделять аддукты альбумина с зоманом, но и также обогащать ими образцы даже в том случае, когда концентрация зомана при инкубировании с ним сывороточного альбумина человека не превышает 10^-7 мг/мл.