4.1.4.2 Расчет удельной поверхности рмм сорбента
С помощью прибора Zetaciser NANO ZC были измерены размеры частиц сорбента, их радиус составил 200нм. Это позволяет нам рассчитать значение удельной поверхности.
Масса одной частицы (формула 2):
(2)
где ρ – плотность стеарата.;
r – радиус частицы, мм.
Для большинства стеаратов плотность лежит в интервале 1.01-1.08 г/мл.
Число частиц в 1 грамме:
(3)
Площадь поверхности 1 частицы
(4)
Удельную поверхность находим по формуле (5):
(5)
Рассчитанное значение удельной поверхности имеет немного большее значение, чем найденное экспериментально, что можно объяснить тем, что при микроэлектрофоретических исследованиях монослои сорбента были подвергнуты дополнительному диспергированию.
4.2 Исследование возможности специфичного выделения фосфорилированных пептидов из биологического образца методом металл-аффинной хроматографии с использованием рммс(Fe III)
Тестовые смеси для проверки качества сорбента должны быть в постоянном использовании, но коммерческие препараты, представляющие собой очищенные фосфорилированные пептиды, очень дороги. Поэтому качестве собственного стандарта были получены и использованы фосфорилированные пептиды казеина коровы. Ферментативный гидролиз казеина проводился без модификации, так как известно, что казеин не содержит S-S-связей. Масс-спектр триптического гидролизата суммарного белка молока представлен на рисунке 4.2.1
А – диапазон масс 1920-1950 Да, Б – диапазон масс 2055-2080 Да (MALDI-ICR)
Рисунок 4.2.1 Масс-спектр гидролизата суммарного белка молока коровы до обогащения
Для идентификации белков была использована программа MS-Fit. Результаты идентификации представлены в таблице 4.2.1.
Таблица 4.2.1 Идентификация суммарного белка коровьего молока
|
Hit Number |
MOWSE Score |
% Cov |
% TIC |
Mean Err, ppm |
Data Tol, ppm |
Species |
Protein Name |
|
1 |
3.74e+9 |
61.7 |
4.4 |
60.8 |
75.7 |
BOVIN |
Alpha-S1-casein |
|
2 |
950398 |
46.4 |
3.0 |
54.9 |
122 |
BOVIN |
Beta-casein precursor |
|
3 |
719894 |
79.3 |
6.9 |
86.5 |
181 |
BOVIN |
Alpha-S2-casein precursor |
|
4 |
496585 |
46.8 |
2.8 |
59.4 |
101 |
BOVIN |
Kappa-casein precursor |
Следует отметить, что все мажорные компоненты масс-спектра, представленного на рисунке 4.2.1, были отнесены программой к Alpha-S1, Alpha-S2, Beta и Kappa субъединицам казеина быка, и с примерно равной долей вероятности все перечисленные субъединицы казеина быка были идентифицированы (таблица 4.2.1). В качестве примера приведем идентификацию Alpha-S1 субъединицы казеина быка. В таблице 4.2.2 представлены MH+ пептидов, которые программой были отнесены к этой субъединице, и три сигнала были определены как относящиеся к фосфорилированным пептидам.
Таблица 4.2.2 Идентификация Alpha-S1 субъединицы казеина быка
|
m/z Submitted |
MH+ Matched |
Delta, ppm |
Modifications |
Start |
End |
Missed Cleavages |
Sequence |
|
831.3794 |
831.3843 |
-5.88 |
|
99 |
105 |
0 |
(K) EDVPSER(Y) |
|
910.4685 |
910.4741 |
-6.16 |
|
140 |
147 |
0 |
(K) EGIHAQQK(E) |
|
1267.6113 |
1267.7045 |
-73.5 |
|
106 |
115 |
0 |
(R) YLGYLEQLLR(L) |
|
1267.6972 |
1267.7045 |
-5.76 |
|
106 |
115 |
0 |
(R) YLGYLEQLLR(L) |
|
1337.6820 |
1337.6808 |
0.894 |
|
95 |
105 |
1 |
(K) HIQKEDVPSER(Y) |
|
1384.7407 |
1384.7300 |
7.74 |
|
38 |
49 |
0 |
(R) FFVAPFPEVFGK(E) |
|
1506.7863 |
1506.7846 |
1.16 |
|
135 |
147 |
1 |
(R) LHSMKEGIHAQQK(E) |
|
1660.7945 |
1660.7942 |
0.185 |
1Phospho |
121 |
134 |
0 |
(K)VPQLEIVPNSAEER(L) |
|
1760.0144 |
1759.9450 |
39.5 |
|
23 |
37 |
0 |
(K) HQGLPQEVLNENLLR(F) |
|
1759.9389 |
1759.9450 |
-3.44 |
|
23 |
37 |
0 |
(K) HQGLPQEVLNENLLR(F) |
|
1767.9052 |
1767.7589 |
82.8 |
|
58 |
73 |
0 |
(K) DIGSESTEDQAMEDIK(Q) |
|
1871.9890 |
1871.9862 |
1.52 |
|
119 |
134 |
1 |
(K) YKVPQLEIVPNSAEER(L) |
|
1927.7027 |
1927.6916 |
5.77 |
2Phospho |
58 |
73 |
0 |
(K)DIGSESTEDQAMEDIK(Q) |
|
1951.9551 |
1951.9525 |
1.34 |
1Phospho |
119 |
134 |
1 |
(K)YKVPQLEIVPNSAEER(L) |
|
2080.0107 |
2080.0709 |
-29.0 |
|
99 |
115 |
1 |
(K) EDVPSERYLGYLEQLLR(L) |
|
2169.1536 |
2169.3668 |
-98.3 |
|
3 |
22 |
1 |
(K) LLILTCLVAVALARPKHPIK(H) |
|
2235.2457 |
2235.2357 |
4.49 |
|
19 |
37 |
1 |
(K) HPIKHQGLPQEVLNENLLR(F) |
|
2316.1452 |
2316.1369 |
3.58 |
|
148 |
166 |
0 |
(K) EPMIGVNQELAYFYPELFR(Q) |
|
3207.5981 |
3207.5932 |
1.53 |
|
140 |
166 |
1 |
(K) EGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFR(Q) |
Кроме того, по результатам обработки, пептиды, отнесенные к Alpha-S1-казеину перекрывают 61.7% аминокислотной последовательности белка, что является очень хорошим результатом.
Аналогичная ситуация наблюдалась и при идентификации остальных субъединиц казеина быка. В то же время, сигналы, отнесенные к фосфорилированным пептидам, являются минорными компонентами спектра, что обусловливает необходимость обогащения образца.
Для проведения процедуры обогащения приготовили микроколонку с сорбентом (рисунок 4.1.1.1) по методике, описанной в п.3.5.1.
Результаты обогащения представлены на спектрах (рис. 4.2.2 а,б; рисунок 4.2.3б вынесен в Приложение Г). Как и в случае идентификации, в качестве примера приведем определение фосфорилированных пептидов, отнесенных к Alpha-S1-казеину. Программой MS-Fit три сигнала были определены, как фосфорилированные пептиды Alpha-S1-казеина, а именно: 1660.7945 Да, 1927.7027 Да и 1951.9551 Да. Причем, пептид с MH+ 1927.7027 Да должен содержать 2 остатка фосфорной кислоты. Действительно, на рисунке 3.2.3.а показаны все три упомянутых сигнала, а также продукты деградации этих пептидов в результате столкновений ионов в накопительной ячейке масс-спектрометра Varian, результатом которого является последовательное отщепление фосфорной кислоты.
Рисунок 4.2.2.а. Масс-спектр смеси пептидов, элюированных с колонки с РММС Fe(III). Область масс 1250-2150 Да (MALDI-ICR).
Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что при обогащении биологических проб фосфорилированными пептидами использование сорбента, содержащего ионы Fe3+, приводит к успешным результатам, поэтому этот сорбент мы использовали в дальнейшей работе.
Стоит отметить, что аналогичный анализ с применением коммерческого аналога показал идентичные результаты.