4.1 Охарактеризация сорбента

4.1.1. Получение рмм сорбента, содержащего ионы железа (III) и приготовление хроматографических колонок.

При образовании монослоя стеариновой кислоты на субфазе происходит гетерофазная реакция взаимодействия ионов Fe³⁺ со стеарат-ионами. При этом образуются стеараты железа, которые нерастворимы в воде и плохо растворяются в большинстве органических растворителей.

2C₁₇H₃₅COO^- + FeOH²⁺ → FeOH(C₁₇H₃₅COO)₂

Таким образом, при взаимодействии монослоев стеариновой кислоты с ионами Fe³⁺ из водной субфазы образуются мономолекулярный слой, который при коллапсировании легко переносится в устройство, используемое как хроматографическая колонка, и применяется в качестве сорбента.

В качестве хроматографических колонок для анализа образца объемом от 5 до 50 мкл использовали пластиковый наконечник для автоматической пипетки (рисунок 4.1.1.1)

Рисунок 4.1.1.1 - Микроколонка с РММ Fe(III) сорбентом

При анализе образов объемом от 50 до 500 мкл были использованы спиновые колонки, представленные на рисунке 4.1.1.2.

Рисунок 4.1.1.2 - Спиновая колонка

При необходимости анализа образцов свыше 500 мкл сорбент наносили на фильтр, предназначенный для удаления механических примесей (рисунок 4.1.1.3).

Рисунок 4.1.1.3 - Фильтр

4.1.2 Определение удельной поверхности

В качестве образцов для проведения эксперимента были выбраны вещества, близкие по строению к МС сорбента – стеариновая кислота и пальмитат алюминия, т.к., получить значения удельной поверхности для наших структур не представилось возможным из-за необходимости синтезирования больших количеств образца на анализ (более 1000 монослоев).

Удельную поверхность исследуемых образцов находили по формуле (1):

, (1)

где S – удельная поверхность исследуемого образца, м²/г;

А – коэффициент интегратора, равный 0,000085 м²/ед;

x – величина сигнала десорбции, ед;

g – навеска исследуемого образца.

Столь малые значения удельной поверхности свидетельствуют об отсутствии пористости. Столь близкие значения удельной поверхности для различных жирных кислот и солей на их основе позволяет оценить удельную поверхность и для сорбента на основе стеариновой кислоты, содержащих ионы железа (III).

4.1.3 Определение емкости сорбента

Результаты, полученные с хроматографа, представлены на хроматограммах (рисунки. 4.1.3.1а,б) и в таблице 4.1.3.1.

Кроме того, чтобы подтвердить соответствие пика хроматограммы анализируемому пептиду, были получены MALDI-масс-спектры как исходного раствора пептида В-60, так и образца, собранного при анализе проскока.

Таблица 4.1.3.1. – отчет хроматографа

Образец	Объем пробы мкл	Высота пика (отн.ед)	Полуширина пика (мкл)	Площадь (от.ед×мкл)	Приведенная площадь
Исходный раствор (В-60)	3	0,88	44,18	40	133,2
Проскок пептида В-60 с сорбента	10	1,29	44,91	60	60

Рисунок 4.1.3.1а Хроматограмма и МС спектр образца В-60

Рисунок 4.1.3.1б Хроматограмма и МС спектр образца проскока пептида В-60 с РММС (Fe III)

Как показано на рисунке 4.1.3.1 а,б с указанным выше временем удерживания действительно элюируется В-60. Кроме того, стоит отметить, что в обоих масс-спектрах имеется сигнал, соответствующий нефосфорилированной форме пептида, причем в масс-спектре проскока его интенсивность значительно выше. Это позволяет сделать выводы, что соотношение фосфорилированной формы и нефосфолирированной меняется в сторону уменьшения количества фосфорилированного пептида, который задерживается на РММС (Fe III).

Зная концентрацию исходного раствора, вычислили количество пептида в исходном растворе. Величина составила 1,08 мг. На хроматограмме такому количеству пептида соответствует пик с площадью 133,2(отн.ед×мкл). Площадь пика образца проскока пептида В-60 равна 60 (отн.ед×мкл). Составив пропорцию, вычислили количество сорбированного образца пептида, равное 0,52мг., что составило 1,1%(масс.доли) от массы влажного сорбента (54мг). Влажность сорбента составила 65%(масс.доли). В пересчете на сухой сорбент (18,9мг) сорбционная емкость составила 2,75%(масс.доли).

Коммерческий аналог (PHOS -Select Affinity Gel) имеет заявленную емкость 0,1 мкмоль ФОС пептида на 1мл сорбента, в пересчете на массу: 0,1мкмоль на 345мг сорбента. При этом количество сорбированного образца пептида РММС Fe(III) в пересчете на моль равна: 0,35 мкмоль на 54мг сорбента или 2,2 мкмоль на 345мг сорбента (приведение к массе коммерческого аналога). Таким образом, РММС Fe(III) по сорбционной емкости превышает коммерческий аналог более чем в 20 раз.