3.7 Масс-спектрометрический анализ

Масс-спектрометрический анализ проводили на следующих масс-спектрометрах: Axima Mass Spectrometer (TOF-TOF, Shimadzu, Япония) и Varian 902-MS MALDI (Fourier Transform (Ion Cyclotron Resonance) Mass Spectrometer (FT(ICR)MS), Varian, США). Подготовку мишени и образцов, а так же обработку данных осуществляли по методике, описанной в п.2.2.6.

3.7.1 Проведение масс-спектрометрического анализа

Ион-циклотронный масс-спектрометр Varian 902-MS MALDI со сверхпроводящим магнитом 9.4 Тесла. Десорбцию и ионизацию пробы осуществляли с помощью третей гармоники (355 нм) Nd:YAG лазера. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 350 до 4500. Масс-спектры регистрировали при помощи программы Omega (Varian, США). В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолиза трипсина (m/z 842.508, 1045.563, 2211.093), которые при обработке удалялись из масс-листов.

Исследования с помощью времяпролетного масс-спектрометра Axima Perfomance с источником MALDI, оснащенном УФ-лазером (337 нм) проводили при следующих настройках: режим детектирования положительных ионов с использованием рефлектрона при следующих настройках ионного источника: напряжение - 20 кВ, напряжение на линзах (lens) 6.5 кВ, напряжения на рефлектроне (Ref) - 24.38 кВ. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 800 до 5000 (в эксперименте in vivo 1900-3000). Анализ проводили в режимах рефлектрона и линейном. Масс-спектры регистрировали при помощи программы MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония). Калибровку проводили по масс-спектру смеси пептидов: ангиотензин 2 (МН⁺ 1046,542 Да), ангиотензин 1 (МН⁺ 2296,685 Да), N-ацетил ренин (МН⁺ 1800,943 Да), аденокортикотропный гормон (1-17) (МН⁺ 2093,086 Да).

0. 4 Обсуждение результатов эксперимента

В связи со спецификой металл-аффинного анализа биологических образцов сорбенты должны соответствовать следующим требованиям.

1. Ионы металла должны быть доступны для исследуемых молекул;

2. Ионы металла должны находится в активной форме;

3. Ионы металла не должны переходить в раствор вместе с исследуемым веществом.

Эти требования трудно удовлетворимы из-за того, что на поверхности твердого тела металл находится чаще всего в форме оксидов. В нашем случае, железо в форме оксида альфа-Fe₂O₃. Однако, пленки Лэнгмюра-Блоджетт, или системы, полученные путем диспергирования монослоев стеариновой кислоты, снятых с поверхности водной субфазы, содержащей ионы Fe (III) имеют поверхность, которая состоит преимущественно из ионов железа, надежно связанных с поверхностью твердого тела. Ранее, было проведено масс-спектрометрическое исследование состава таких пленок и было показано, что основным структурным звеном монослоя является St₂Fe⁺ [29], что позволило сделать предположение, что описанные структуры могут являться металл-аффинными сорбентами, а содержание в них железа (III) обуславливает их специфичность к фосфорсодержащим пептидам.

Пептиды можно отнести к макромолекулам. Молекулярные массы пептидов, успешно анализируемых методом MALDI-масс-спектрометрии, варьируются в диапазоне 1000-3000 Да. Соответственно, можно ожидать, что основную роль будет играть не удельная поверхность сорбента, т.к. анализируются микроколичества вещества, а непосредственно структура поверхности (количество и форма существования ионов металла). Необходимо отметить, что пористость также не должна оказывать влияние на эффективность сорбции, т.к. адсорбция больших органических молекул происходит не в порах, а на геометрической поверхности сорбента. Кроме того, если макромолекулы и проникали бы в поры, было бы затруднительно их оттуда извлечь. Таким образом, регулярные мультимолекулярные структуры (пленки Лэнгмюра-Блоджетт), содержащие железо (III) (РММС Fe(III)) соответствуют требованиям, предъявляемым металл-аффинным сорбентам.