- •Содержание
- •1 Аналитический обзор 11
- •2 Методическая часть 29
- •3. Экспериментальная часть 37
- •4 Обсуждение результатов эксперимента 44
- •Условные обозначения
- •Введение
- •1 Аналитический обзор
- •1.1 Регулярные мультимолекулярные структуры
- •1.2 Хроматография
- •1.2.1 Металл-аффинная хроматография – сочетание принципов лигандообменной и аффинной хроматографии
- •1.3 Методы характеризации сорбентов
- •1.3.1 Удельная поверхность
- •1.3.2 Емкость сорбента, влажность
- •1.3.3 Электрокинетический потенциал
- •1.4 Maldi масс-спектрометрия
- •1.5 Идентификация белков – метод pmf
- •1.6 Тандемная масс-спектрометрия (мс-мс) и идентификация пептиов по фрагментным масс-спектрам
- •1.7 Идентификация пост-трансляционных модификаций
- •1.8 Аддукты зомана с сывороточным альбумином
- •2 Методическая часть
- •2.1 Используемые материалы:
- •2.2 Методики получения сорбента и исследования
- •2.2.1 Получение рмм (FeIii) сорбента
- •2.2.2 Определение удельной поверхности сорбента
- •2.2.3 Определение сорбционной емкости сорбента
- •2.2.3.1 Проведение металл-аффинного анализа
- •2.2.3.2 Определение влажности рмм Fe(III) сорбента
- •2.2.3.3 Определение влажности коммерческого сорбента
- •2.2.4 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •2.2.4.1 Выделение суммарного белка из обезжиренного сухого молока
- •2.2.4.2 Гидролиз суммарного белка молока коровы в присутствии трипсина
- •2.2.5 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •2.2.5.1 Гидролиз сывороточного альбумина человека в присутствии пепсина
- •2.2.6 Масс-спектрометрический анализ
- •2.2.6.1 Масс-спектрометрический анализ методом maldi-tof и maldi-tof-tof
- •2.2.6.2 Обработка данных масс-спектрометрического анализа
- •3. Экспериментальная часть
- •3.1. Получение рмм Fe(III) сорбента
- •3.2 Определение удельной поверхности
- •3.3 Определение электрокинетического потенциала и размера частиц.
- •3.4 Определение сорбционной емкости сорбента
- •3.4.1Проведение металл-аффинного анализа
- •3.4.2 Определение содержание пептида в проскоке и контрольном образце
- •3.4.3 Определение влажности коммерческого сорбента и рммс Fe(III)
- •3.5 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •3.5.1 Приготовление микроколонки с сорбентом
- •3.5.2 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.5.3 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.6 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •3.6.1 Приготовление металл-аффинной колонки
- •3.6.2 Выбор элюэнта
- •3.6.3 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.6.4 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.7 Масс-спектрометрический анализ
- •3.7.1 Проведение масс-спектрометрического анализа
- •4 Обсуждение результатов эксперимента
- •4.1 Охарактеризация сорбента
- •4.1.1. Получение рмм сорбента, содержащего ионы железа (III) и приготовление хроматографических колонок.
- •4.1.2 Определение удельной поверхности
- •4.1.3 Определение емкости сорбента
- •4.1.4 Микроэлектрофоретические исследования.
- •4.1.4.1 Определение электрокинетического потенциала
- •4.1.4.2 Расчет удельной поверхности рмм сорбента
- •4.2 Исследование возможности специфичного выделения фосфорилированных пептидов из биологического образца методом металл-аффинной хроматографии с использованием рммс(Fe III)
- •4.3 Разработка метода металл-аффинного выделения прямых ковалентных аддуктов зомана с сывороточным альбумином с помощью рмм сорбентов Fe(III) для последующего масс-спектрометрического анализа
- •4.3.1 Поиск и идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с зоманом
- •4.3.2 Выделение фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека с использованием рммс (Fe III)
- •4.3.2 Масс-спектрометрическая идентификация сайтов связывания зомана с альбумином при взаимодействии с белками in vitro
- •Выводы по работе:
- •Список использованных источников.
- •Приложение а Технико-экономическая оценка научно-исследовательской работы Обоснование договорной цены на разработку
- •Расчет затрат на научно-исследовательскую разработку
- •Расчет затрат на сырье, материалы, реактивы, покупные изделия и полуфабрикаты
- •Расчет затрат на энергоресурсы
- •Расчет затрат на приборы, оборудование для научно-экспериментальных работ и суммы амортизационных отчислений
- •Расчет затрат на оплату труда с обязательными начислениями
- •Прочие затраты Расчет суммы расходов по использованию вычислительной техники.
- •Затраты на выполнение специальных анализов.
- •Расчет суммы накладных расходов
- •Расчет сметы затрат на разработку
- •Приложение б Охрана труда и окружающей среды
- •1 Опасные и вредные производственные факторы
- •2 Пожарная безопасность
- •3 Обеспечение санитарно-гигиенических условий
- •4 Вентиляция
- •5 Аптечка и ее содержание
- •6 Освещение помещения
- •7 Безопасность выполнения работы в лаборатории
- •8 Анализ технологических операций
- •9 Меры первой помощи
- •Охрана окружающей среды
- •Приложение в
- •Приложение г Масс-спектры смеси триптических пептидов казеина, элюированных с колонки с сорбентом, содержащим ионы железа.
3.6 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
Гидролиз сывороточного альбумина человека в проводили по методике, описанной в п.2.2.5 в присутствии пепсина.
3.6.1 Приготовление металл-аффинной колонки
Основой для колонки служил фильтр, предназначеный для отделения механических примесей из растворов. Для удобства наполнения сорбентом на фильтр установили стаканчик, сделанный из пластикового наконечника.
К 30 ММС сорбента добавили 96% этиловый спирт. 100мкл полученной взвеси при помощи автоматической пипетки нанесли на стаканчик фильтра и шприцом продавили через фильт, отделив спирт. Таким образом нанесли все 30 монослоев сорбента, контролируя точное количество по сопротивлению поршня шприца.
3.6.2 Выбор элюэнта
При работе с РММС Fe(III), были опробованы следующие элюенты: NEt3, N2H4·H2O, N+Me4·OH, DMSO, ДМФА, CH3CN, в концентрациях 0,1%-е и 0,5%-е, NaOH, раствор NH3 в концентрации 5%. Также были опробованы в качестве буферов для связывания 0,1% ТФУ, вода, 0,1 М NH4HCO3. Все элюаты проверялись качественной реакцией на ионы Fe3+ с роданидом калия.
3.6.3 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
100 мкл раствора сорбента (Fe3+-содержащий гель (PHOS-Select Iron Affinity Gel, Sigma)) нанесли на спиновую колонку. Колонку три раза промыли 0.1% ТФУ. 30 мкл образца растворили в 70 мкл 0.1% ТФУ и перенесли в колонку с сорбентом. Колонку поместили в микропробирку и инкубировали в течение 15 минут на качающейся платформе, после чего проскок удалили с фильтра в микропробирку. Чтобы избежать неспецифической сорбции, сорбент трижды промыли 100 мкл 0.1% ТФУ и центрифугировали 30 секунд при 5000 об/мин. Для ступенчатого элюирования на колонку, помещенную в новую микропробирку, нанесли 100 мкл первого элюирующего раствора (0.1 М аммонийбикарбонатный буфер), смесь инкубировали в течение 10 минут на качающейся платформе, после чего центрифугировали 30 секунд при 5000 об/мин. Процедуру элюирования повторили дважды. Затем на колонку наносили 100 мкл второго элюирующего раствора (400 мМ гидроксид аммония) и смесь инкубировали в течение 10 минут на качающейся платформе, после чего центрифугировали 30 секунд при 5000 об/мин. Процедуру элюирования повторили трижды, элюат отбирали для анализа. Затем на колонку наносили 100 мкл третьего элюирующего раствора (0.5% раствор пиперидина) и смесь инкубировали в течение 10 минут на качающейся платформе, после чего центрифугировали 30 секунд при 5000 об/мин. Процедуру элюирования проводили один раз. Все элюаты, полученные с использованием одного и того же элюента, объединяли.
3.6.4 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
36 мг сухого мономолекулярного пленочного сорбента, содержащего ионы железа (III) наносили на колонку. Колонку при помощи шприца промывали 200 мкл 100%-ого ацетонитрила, затем промывали 200 мкл 0,1% ТФУ в воде. 40 мкл образца (40 мг/мл белка) растворяли в 160 мкл 0,1% ТФУ и наносили на колонку, содержащую сорбент. Колонку поместили в микропробирку и инкубировали в течение 15 минут на качающейся платформе, после чего проскок удалили с фильтра в микропробирку. Чтобы избежать неспецифической сорбции, сорбент при помощи шприца трижды промыли 100 мкл 0.1% ТФУ. Для ступенчатого элюирования на колонку, помещенную в новую микропробирку, нанесли 100 мкл первого элюирующего раствора (0.1 М аммонийбикарбонатный буфер), смесь инкубировали в течение 10 минут на качающейся платформе, после чего элюат отделяли. Процедуру элюирования повторили дважды. Затем на колонку наносили 100 мкл второго элюирующего раствора (400 мМ гидроксид аммония) и смесь инкубировали в течение 10 минут на качающейся платформе, после чего элюат отделяли. Процедуру элюирования повторили трижды, элюат отбирали для анализа. Затем на колонку наносили 100 мкл третьего элюирующего раствора (0,5 % триэтиламин) и смесь инкубировали в течение 10 минут на качающейся платформе. Процедуру элюирования проводили один раз. Затем на колонку наносили 100 мкл следующего элюирующего раствора (100% ацетонитрил) и смесь инкубировали в течение 10 минут на качающейся платформе. Процедуру элюирования проводили один раз. Все элюаты, полученные с использованием одного и того же элюента, объединяли.